用于临床样品的细胞浓度和活力

专注力和活力概论

由于红细胞(rbc)和细胞碎片的存在,在临床样本中测量有核细胞的活力和浓度是固有的困难。为了去除污染的红细胞,临床样本如PBMCs、骨髓和脐带血常规进行红细胞溶解或梯度分离。但即使是这些方法也不总是能成功地去除所有的红细胞,并且在测定细胞浓度时直接导致显著的错误。通过使用以下所述的Cellometer双荧光方法,我们消除了对红细胞裂解和ficoll梯度的需要。因此,我们可以测量所有初级临床样本的活力和浓度,而不需要从样本中去除红细胞。

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Cellometer双荧光计数法

为了测定的可活力测定,将20μl样品与20μLCTOR计AO / PI染色溶液混合。吖啶橙(AO)染料在所有核细胞中染色DNA,产生绿色荧光。碘化丙啶(PI)用损伤的细胞膜染色了所有细胞中的DNA,产生红色荧光。在用AO和PI染色的细胞中,通过FRET(荧光共振能量转移)被红色荧光吸收绿色荧光。所有死核细胞荧光红色(图像远右侧)。所有活成核细胞荧光绿色(图像右)。在荧光图像中计数活和死细胞。

红细胞(RBC),血小板和碎片不荧光,并且不包括细胞计数,因此AO / PI活力法不需要样品溶解。

AO / PI染色细胞图像

临床新鲜样本的TNC活力

新鲜临床样本的细胞图像

因为新鲜的临床样品含有非常高的血小板和红细胞,因此有时不评估进入样品的TNC浓度。在一些实验室中,样品裂解用于TNC分析,但不能确定细胞活力。

Cellometer AO / PI双荧光方法可用于容易测量新鲜临床样品中的TNC浓度和活力,例如骨髓,脐带血和外周血而不会裂解。

AO /π分析过程:

  • 用PBS稀释骨髓,脐带血或外周血样品1:10。
  • 将20μl稀释样品与20μLAO/ PI染色溶液组合。
  • 将20µl染色样品加入Cellometer计数室,并插入或插入Cellometer自动细胞计数器,如Cellometer Auto 2000, Cellometer K2或Cellometer Vision CBA。
  • Cellometer系统自动捕获并分析光盘和荧光图像。
  • 自动数据报告提供了活的和死的有核细胞的细胞计数、浓度和平均直径以及样本的%活力。

新鲜骨髓抽吸分析结果

亮视场图像

所有的细胞

绿色荧光图像

活成核细胞

红色荧光图像

死核细胞

数据报告

新脐带血分析结果

亮视场图像

所有的细胞

绿色荧光图像

活成核细胞

红色荧光图像

死核细胞

数据报告

新鲜外周血分析结果

亮视场图像

所有的细胞

绿色荧光图像

活成核细胞

红色荧光图像

死核细胞

数据报告

报表会自动显示在屏幕上。带有图像的打印报告可以直接从Cellometer软件生成

跨国公司和PBMC分析

通过密度梯度分离去除RBC和血小板后,使用台盼蓝染色来手动计算样品以计算存活率。因为样品可以含有在密度梯度分离后的不同量的RBC污染,所以在该阶段使用AO / PI双荧光法用于样品的样品提供提高的精度和再现性。

AO /π分析过程:

  1. 将20μl样品与20μLAO/ PI染色溶液组合。
  2. 将20µl染色样品加入Cellometer计数室,并插入Cellometer自动细胞计数器,如Cellometer Auto 2000, Cellometer K2或Cellometer Vision CBA。
  3. Cellometer系统自动捕获并分析光盘和荧光图像。
  4. 自动数据报告提供了活的和死的有核细胞的细胞计数、浓度和平均直径以及样本的%活力。

PBMC样本分析结果

亮视场图像

所有的细胞

绿色荧光图像

活成核细胞

红色荧光图像

死核细胞

数据报告

如下所示,密度梯度分离后样品中可能存在RBC污染。

使用AO / PI方法消除了通过计数RBC而引起的潜在误差。

在PBMC样品中染色核细胞

PBMC样品中存在的RBC在用Cellometer Vision 10x仪器(远留)获取的明场图像中可见。因为RBCS不含DNA,因此它们不被AO染色,并且不计为绿色荧光图像中的活成核细胞(靠近左侧)。

红细胞污染的影响

RBCS未被AO / PI染色,并且不通过Cellometer软件识别

红细胞在显微镜下看起来像白细胞。在手工统计跨国公司时,常常可以将它们包括在内。

PBMC明亮的场地图像

在Cellometer Vision仪器拍摄的图像中,血小板、白细胞和红细胞可以被识别并计数,以测量样品中的红细胞污染量。

密度梯度分离后出现RBC污染

在15个随机的PBMC样本中,4个样本显示高度RBC污染,6个样本显示中度RBC污染。

RBC污染存在于MNC和PBMC样品中。

红细胞污染的量因样本的不同而不同。

手动计数在使用RBCS中高估PBMC计数和活力

对于含有高RBC污染的样品,手动计数超过估计的WBC浓度〜25%至50%。

AO / PI细胞计数与实际PBMC计数紧密相匹配。

AO/PI提供了更准确的红细胞污染样品中PBMC浓度和活力。

纯化临床样品分离的细胞群分析

在免疫磁性分离后,样品显示出高纯度,并且可以使用各种计数方法精确计算,包括台盼蓝和AO / PI。无论是从骨髓,脐带血或外周血中分离,分离的细胞群通常都是非常干净的,没有RBC或血小板污染。下面示出了从不同类型样品中分离的特异性细胞群的几种实例。它们的外观都非常相似。点击这里查看CD34+视频,了解Cellometer AO/PI分析分离细胞群的演示。

来自NPB的CD56 + NK细胞

来自CB的CD34+干细胞

来自NPB的CD19 + B细胞

AO/PI与临床样本手工计数的相关性

作为合作的一部分AllCells,质量主要细胞的提供者,Nexcelom科学家将两个流行的明亮场计数方法与Cellometer AO / PI双荧光计数进行了比较。结果对亚甲基蓝计数方法(所有样品类型)和台盼蓝计数方法(用于隔离的细胞群)相关性。

与手工计数的强相关性使得许多实验室能够在最少的文档和测试的情况下实现对Cellometer AO/PI计数方法的更改。

新鲜样品AO/PI和亚甲基蓝TNC计数相关性好

裂解/染色了十六个样品(外周血,脐带血和骨髓抽吸物)3%乙酸/亚甲基蓝和手工计算。

用染色每种样品的第二等分试样AO / PI没有裂解并与之计算Cellometer Auto 2000.

虽然3%乙酸/亚甲基蓝色方法提供精确的TNC计数,但它不测量细胞活力。

AO/PI方法不需要细胞裂解。

台盼蓝和AO / PI计数适用于纯化的样品

24个纯化样品(CD14+、CD19+和CD34+细胞)的台盼蓝与AO/PI相关性良好

6个跨国公司的样本也没有相关性。由于红细胞污染,台盼蓝计数增高。(红圈)

台盼蓝或AO/PI可准确测定分离细胞群(如CD34+、CD56+、CD19+)的浓度和活力。

Cellometer细胞计数的好处

  • 探讨含有红细胞,血小板和碎片的样品的性能
  • 一种优化的双荧光方法,用于分析新鲜和处理的临床样品,而不裂解
  • 用于对纯化样品进行传统的台盼蓝或双荧光活力测定的选择
  • 证明与传统计数方法的相关性
  • 提高了计数结果的准确性和一致性
  • 自动保存和打印结果和图像
  • Nexcelom应cf欧洲杯竞猜用专家专注于细胞计数和基于细胞的分析
  • Cellometer细胞计数器已经被用来计数超过1600种不同的细胞类型
  • Cellometer细胞计数器被排名前十的制药公司和所有40个NCI综合癌症中心使用
  • 免费在线和现场培训和客户支持