在不溶RBC的情况下,准确计数PBMCs和测定活力

外周血单核细胞(PBMC)介绍

使用外周血单个核细胞(PBMC)样本可能是棘手的。目前,许多用户使用血球计和光学显微镜来手工计数他们的pbmc。然而,标准的光学显微镜并不能始终区分白细胞和红细胞(RBC)。因此,这种手工方法可能导致样品浓度和活力的测定被高估。此外,红细胞的双凹面形状只能通过特殊的光学装置、聚焦技术和训练有素的操作人员来识别。另一个挑战是不同样本的红细胞和血小板污染程度差异很大。这增加了使用一组条件快速而简单地计算和测量可行性的难度。

PBMC细胞概述计数挑战

  • 仍有大量用户使用血球计和光学显微镜手工计数pbmc

  • 标准光学显微镜不能一致地区分白细胞和红细胞

  • 红细胞的双凹面形状只能通过特殊的光学装置、聚焦技术和训练有素的操作人员来识别

明亮的田间形象

样本差异大

每个样品的红细胞和血小板污染程度各不相同,因此很难用一套条件快速而简单地计数和测量生存能力。

准确计数和生存能力的重要性

外周血单个核细胞用于测定免疫功能。检测包括增殖、细胞毒性和细胞因子的产生。低温保存的pbmc在临床试验和生物医学研究中都非常重要。

在癌症免疫治疗中,白细胞分离常用于从病人血液中分离免疫系统细胞。然后根据疫苗的设计,将细胞扩大或暴露于不同的制剂中。然后将活性细胞注入病人体内。细胞浓度和活力是整个生产过程中监测的基本参数。

Ficoll通常用于从骨髓、外周血和脐带血中分离单个核细胞。单核细胞和淋巴细胞在一层血浆下面形成一层浅黄色的被膜。细胞被收集和清洗。通常情况下,一些残留的血小板或红细胞混合在单核细胞中。

低温保存PBMC的功能测定与细胞活力有关。临床试验中应采用生存能力阈值,以获得可靠的功能测定结果。

PBMC实验的特征

  • 电池质量随时间下降
  • 大量的样本通常与临床试验有关
  • 细胞标本不纯,分离质量取决于患者标本和操作者

常规测量电池分离,加工和冷冻保存的活性PBMC浓度和活力

  • 标签用于细胞分离的磁珠
  • 抗体标记和染色用于荧光活性细胞的分类和分析
  • 加入低温鸡尾酒前的低温保存
  • 解冻后质量控制

获取准确的PBMC细胞计数需要考虑的选项

单样品细胞计数器
高通量细胞计数器

消除红细胞计数误差的方法

新鲜人PBMC样品中残留RBC的鉴定

方法

使用荧光Cellometer自动细胞计数器和手动计数红细胞和白细胞的图像样本

程序

  1. 将20µl新鲜样品移液至Cellometer一次性细胞计数室
  2. 用光场成像方法建立Cellometer
  3. 调整聚焦以识别红细胞的双凹面形态
  4. 从计数室的4个位置捕捉细胞图像
  5. 打印单元格图像
  6. 手动枚举细胞,没有双阳细胞形态。血小板不计数,如较小的细胞尺寸所示。

RBC裂解后PBMC样品中红细胞的残余存在

从捕获的亮场图像手动识别红细胞(红色圈)和白细胞(蓝色圈)。在手工计数PBMC样本时,这些残留的红细胞可能导致计数不准确。

15份新鲜人PBMC样本检测结果:

  • 4个样本RBC污染程度高(大于30%)
  • 6个样本显示中度红细胞污染(10%至30%)
  • 5个样本显示低或无RBC污染(小于10%)

RBC污染物%= RBC计数/总细胞计数(X100)

15个PBMC样本中RBC污染的数据

15份新鲜人PBMC标本中有和没有双凹形态的细胞数量。这清楚地显示了残余红细胞的数量随样本的不同而不同,从0%到50%不等。

不裂解红细胞的PBMC样品的准确双荧光分析

Nexcelom优化了双荧光染色法,简单、准确测定浓度和活力。AO/PI染色的样品可以用Cellometer汽车2000, 或者Cellometer K2.使用预优化设置的仪器进行PBMC分析。

吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)是荧光核酸污渍,用于测量各种细胞类型中的核细胞活力,包括哺乳动物细胞系,哺乳动物原代细胞和酵母。

  • AO是一种膜可渗透的染料,染色成核的活细胞。
  • PI是一种膜的不透水染料,染色膜受损(不可用)核细胞的红色。
  • 非活细胞实际上是由AO和PI染色的。由于荧光谐振能量转移(FRET),AO荧光能量被转移到PI,允许非活细胞仅荧光红色。
  • 溴化乙锭可用于代替碘化丙锭剂

AO / PI染色样品没有RBC裂解

住PBMC 死PBMC 红细胞和血小板
吖啶橙(AO)染色 积极的绿色污点 积极的绿色污点 没有污点/没有污点
碘化丙啶(PI)染色 没有污点 积极的红色污点 没有污点/没有污点

因为血小板和成熟的红细胞没有细胞核,所以它们不能被细胞核染色剂染色。

使用双荧光法,红细胞、血小板或碎片的计数没有误差。红细胞裂解不需要。

PBMCs中有红细胞和血小板

虽然亮场图像显示存在RBC,但Cellometer软件未对其进行染色或计数

AO/PI双染色法对总有核细胞计数的验证

A.使用AO / PI染色和Cellometer自动细胞计数器直接测量总核细胞

  1. AO/PI按1:1比例染色
  2. 将20μl染色的电池样品进入计数室
  3. 使用荧光晶片单元计数器计数和分析PBMC样品

B.计数样品总核数

  1. 用3%乙酸粘合相同的样品15分钟释放核
  2. 台盼蓝(TB)染色细胞核
  3. 光学显微镜下用血球计手工计数台台虫染色细胞核

样品制备

C.比较锥虫染色细胞核总数与AO/PI直接测量的有核细胞数

  1. 样本统计。结果显示AO/PI染色的PBMC与台台蓝染色的细胞核计数相当,说明AO/PI染色的细胞是有核的PBMC。

计算结果

AO/PI法与人工白细胞计数的PBMC计数比较

A.使用AO / PI染色和Cellometer自动细胞计数器直接测量总核细胞

  1. 用AO / PI染色新鲜的人类样品(20UL细胞样品+ 20UL AO / PI)
  2. 使用荧光晶圆计单元计数器计数和分析样品
  3. 记录AO / PI单元格计数和样本ID
  4. 比较图2中报告的AO/PI和白细胞计数

B.将AO / PI细胞计数与RBC和白细胞计数进行比较。

结果

在AO / PI和所有样品的手动计数之间获得相当的白细胞计数。(平等长度的绿杆和蓝色栏)

使用手工方法和AO/PI方法的细胞计数之间的差异等于每个样本的红细胞数量。

结论AO/PI染色可消除人工计数中残留红细胞引起的误差。

AO / PI和手动计数之间的可比白细胞计数

AO/PI分析性能-计数范围,重复性和一致性

使用新鲜PBMC测量细胞浓度线性和一致性

  • 使用PBS产生连续稀释的样品
  • 用吖啶橙和溴化乙锭混合物(或AO/PI混合物)在每种稀释度下染色样品。
  • 每次稀释加入10个计数室
  • 使用荧光Cellometer细胞计数器测量活/死细胞浓度和活力
  • 通过测定2×10的活细胞浓度7.2×105.
  • 变异系数范围为3.5%至14.1%,即在可接受的范围内。

PBMCs稀释级数呈R线性关系2= 0.9991

PBMC稀释系列结果

稀释因子 生活(细胞/毫升) std(n = 10) %的简历
1 2.2 e + 07 7.6 e + 05 3.5
0.5 1.1 e + 07 3.4E + 05. 3.0
0.25 5.0e + 06. 2.4 e + 05 4.8
0.125 2.6 e + 06 1.6 e + 05 6.2
0.0625 9.7 e + 05 5.3 e + 04 5.4
0.03125 4.1e + 05 5.6e + 04 13.9
0.015625 2.1E + 05. 2.9 e + 04 14.1

AO/PI法测定新鲜PBMC活力的时间-过程

将新鲜样品储存在4℃。在第1天,第4天和第7天,使用以下步骤将细胞样品除去每个时间点的可存活率测量:

  • 用吖啶橙和溴化乙啶混合物(或AO/PI混合物)染色细胞
  • 每次稀释加入10个计数室
  • 使用荧光晶圆计细胞计数器测量活力

当将新鲜的PBMCS样品储存在4℃时,通过储存时间减少了活力。

为PBMC细胞计数选择正确的Cellometer

Cellometer迷你 Cellometer汽车T4 Cellometer汽车1000 Cellometer汽车2000 Cellometer K2. Cellometer频谱
培养的pbmc -无碎片
培养的PBMCs -碎片
新鲜的含红细胞溶解的pbmc
新鲜的PBMC没有裂解
冷冻PBMCs

=优秀=很好=好=不推荐

结论

使用血细胞计和光学显微镜的当前PBMC枚举方法可以包括供体依赖性的RBC诱导的计数误差。

采用Cellometer图像流式细胞仪自动计数AO/ pi染色的有核细胞,消除rbc诱导的计数误差。

比较荧光细胞计数器用于PBMC细胞计数»

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