血小板

介绍血小板

血小板常用于血液疾病的凝血因子研究。因此,血小板的凝血因子和特性在心血管和输血医学中具有重要意义。由于它们的大小(约2微米),它们很难可视化和计数。钙黄素AM染色后,X2、K2、Vision 10x、Vision和Auto 2000等多种Cellometer仪器可对其进行识别、成像和计数。

问一个专家
请求报价

钙黄素AM (Calcein acetoxymethyl ester)是一种细胞可渗透的非荧光化合物。钙黄素AM穿过细胞膜后,在活细胞内被细胞酯酶迅速水解。水解AM基团,将非荧光钙黄素AM转化为强绿色荧光钙黄素。因为生成的钙黄蛋白更亲水,所以它被困在细胞膜完好的细胞内。没有活性的细胞质酯酶的细胞不能将钙黄素AM转化为钙黄素,因此不能发出绿色荧光。这允许快速和简单的检测样品中的代谢活性细胞。

钙黄绿素是

疏水性(容易被细胞吸收)

内源性细胞内酯酶

钙黄绿素

亲水性的(残留在细胞膜完整的细胞质中

由于钙黄素AM不需要DNA结合,它可以染色所有代谢活性细胞,并可用于测量无核细胞(如血小板)的代谢活性12.由于钙黄素AM耐光性好,细胞毒性低,不影响细胞功能,是检测细胞活力和代谢活性的常用染色剂。

全血血小板测定方法

钙黄素AM试剂的制备

  1. 移液2µl Calcein AM到18µl的dH中2这是现在钙黄素AM溶液A.用移液器上下搅拌至少15次。

血小板染色程序

  1. 将5µl的血小板样品加入85µl的1x PBS中稀释。上下移液搅拌均匀。
  2. 加入5µl的钙黄素AM溶液A至45µl稀释后的血小板标本。
  3. 轻轻上下移液10次,37℃避光孵育20分钟。
  4. 孵育20分钟后,样品就可以进行分析了。
  5. 通过上下移液至少10次,将细胞样品轻轻混合,然后将20µL装入Cellometer计数室并插入Cellometer仪器。
  6. 等60秒,让这些细胞进入房间
  7. 在示例ID文本框中键入示例的名称
  8. 稀释倍数设置为20。

钙黄素AM染色酶活性血小板的检测

稀释的全血样本的亮场图像

钙黄素AM染色细胞的荧光图像

Calcein AM染色细胞的荧光计数图像

结果

计数完成后,Cellometer软件自动报告计数到的钙黄素AM活性的细胞总数和细胞浓度。上面显示的是捕获的亮场,捕获的荧光,和从整个血液样本计数的荧光图像。钙钙素AM只对白细胞和血小板进行染色,红细胞不染色,不影响计数。在已计数的荧光图像中,已计数的粒子用绿色圆圈勾勒出来。在这种情况下,只计数血小板,而用黄色圆圈标出的白细胞,根据其细胞大小排除在计数之外。

血小板亮场检测及浓度测定

分离纯化血小板的实验室可以使用亮场成像测量血小板浓度。本试验仅推荐用于没有红细胞或其他污染细胞碎片(包括富血小板血浆(PRP))的纯化血小板样本。

纯化血小板测定方法

样品制备

  1. 将5µl的血小板样品加入95µl的1x PBS溶液中稀释。上下移液搅拌均匀。
  2. 用移液法将细胞样品缓慢地上下混合至少10次,然后将20µL装入计数室。
  3. 等60秒,让这些细胞进入房间。
  4. 在示例ID文本框中键入示例的名称。
  5. 稀释倍数设置为20。

利用亮场成像测量血小板浓度

纯化血小板的明亮视野

计数亮场象

纯化血小板测定结果

结论

使用Cellometer图像流式细胞术对含血小板的临床样本进行血小板计数是理想的。仪器在30秒内测量血小板浓度的能力提高了计数效率和一致性。血小板可以用钙黄素AM染色,以确定样品的活力和测定酶活性血小板的浓度在一个单一的分析。要确定哪种仪器最适合你,请联系Nexcelom的专家。

使用Cellometer进行血小板分析的出版物

  • Sa Q和Hoover-Plow JL。(2011) EMILIN2(弹性蛋白微原纤维界面定位蛋白),血栓形成的潜在调节剂。血栓形成杂志9 (9): 1 - 8
  • 张丽萍,张晓燕,张晓燕,等。血小板toll样受体9与内源性配体的结合促进血小板高反应性和血栓形成。循环研究112(1): 103 - 12所示
  • Zhao Y, Malinin NL, Julia Meller J等(2012)Calpain切割Kindlin-3对细胞粘附和迁移的调控。生化化学杂志287 (47): 40012 - 20

利用钙黄素AM进行血小板分析的出版物

  1. Morrell CN, Matsushita K, Chiles K等(2005)s -亚硝基化对血小板颗粒胞外分泌的调控。PNAS 102 (10): 3782 - 7
  2. Verheul HMW, Jorna AS, Hoekman K等(2000)血管内皮生长因子−刺激的内皮细胞促进血小板的粘附和激活。血96(13):4216 - 21所示