检测凋亡事件

凋亡介绍

细胞凋亡,即程序性细胞死亡,是维持组织稳态和调节生理功能所必需的正常过程。细胞凋亡的激活途径主要有两种:外在途径和内在途径。外部途径由配体(包括TNFα, FasL和TRAIL)与细胞表面受体的结合激活。当有毒药物或紫外线照射导致DNA或细胞损伤时,固有的或线粒体途径通常会被激活。在蛋白水解caspase-3时,内源性和外源性途径的汇合发生。

请求报价
问一个专家

目前,Cellometer Vision CBA系统可以通过检测Caspase 3和8、JC-1和Annexin V来检测细胞凋亡。

外部和内部凋亡途径

改编自《胆道上皮病理生理学》ISBN: 1-58706-171-6

膜联蛋白V和坏死的检测

膜联蛋白V概述

另一种凋亡检测方法是膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)检测。膜联蛋白V是细胞内膜联蛋白家族的一员,以钙依赖的方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。在健康细胞中,PS通常只在质膜的细胞内叶上存在,但在细胞凋亡时,PS易位到外部叶上。荧光标记的膜联蛋白V可以特异性靶向并识别凋亡细胞表面的PS。单独结合膜联蛋白V并不能区分凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。碘化丙啶溶液是一种膜排斥染料,它能进入细胞膜受损的细胞并与DNA结合。早期凋亡和膜完整的健康细胞将排除PI,而晚期凋亡和坏死的膜受损细胞将被PI染色。使用Annexin V-FITC和PI,研究人员可以根据%正常、%凋亡和%坏死/极晚期凋亡细胞来描述细胞群。

积极的控制通常是必要的,以优化实验方案和获得仪器基线。在Cellometer的例子中,阳性对照是用10µM α-TOS(一种诱导凋亡的药理学试剂)过夜处理Jurkat细胞产生的。阴性对照样品未使用α-TOS处理。

亮场和荧光细胞图像

上图为凋亡阳性样品的三张显微照片:亮场、Annexin V(绿色)和PI(红色)。这些捕获的Cellometer图像中的荧光强度数据被导出到FCS Express软件中。

荧光强度数据图

数据显示为散点图,每个象限代表一个特定的细胞群。左下象限显示Annexin V和PI阴性的活细胞。左上角象限显示只有PI阳性的死亡/碎片细胞。右下象限显示Annexin V阳性的凋亡细胞。右上象限显示Annexin V和PI阳性的坏死细胞。

细胞群和浓度数据表

该表显示了活细胞、凋亡细胞、坏死细胞和碎片细胞的数量。

JC-1活性检测

JC-1概述

另一种检测细胞凋亡的方法是通过检查JC-1,一种线粒体膜电位染料。在健康的细胞中,JC-1在细胞膜上扩散到其荧光绿色的细胞质中。由于JC-1的阳离子特性,它迁移到线粒体中,其中净负电荷为-180 mV。由于线粒体内的JC-1的浓度增加,JC-1开始形成荧光红色的聚集体。然而,在经历细胞凋亡的细胞中,或者在已经用药物(例如CCCP)处理的细胞中,线粒体膜电位的损失可防止JC-1在线粒体内的聚集体形成聚集体,因此在细胞质中的JC-1荧光荧光绿色。线粒体膜的渗透率导致细胞色素C的释放,胱天蛋白酶9和Caspase 3的活化。

收集培养的Jurkat细胞,在37°C下不(对照)或与羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)一起孵育,以破坏线粒体膜电位5分钟

CCCP孵育后,用JC-1试剂盒(LifeTechnologies)对细胞进行染色:将10 μl JC-1(200µM)加入1 ml Jurkat细胞(~2×10^6)中,每个样本在培养箱中孵育30分钟。(染色后水洗为可选,本实验未进行。)

JC-1作为膜电位染料的作用模式

改编自普渡细胞检测光盘系列,第3卷

控制细胞Jurkat

未经处理的Jurkat细胞用JC-1染色,Cellometer Vision CBA成像,数据导出到FCS Express软件。健康细胞主要表现为水户红在线粒体内的聚集,如亮红色染色所示,水户红在10^4处有一个强强度峰值。

明亮的视野,水户绿色和水户红色健康Jurkat细胞的图像

平均强度数据图:控制Jurkat细胞

CCCP处理的Jurkat细胞

Jurkat细胞经CCCP(羰基氰化物-氯苯酰腙)处理后,用JC-1染色,Cellometer Vision CBA成像,数据输出到FCS express。线粒体膜电位的损失导致水藤红的急剧下降,在荧光图像和生成的直方图中都可以看到。

明亮的领域,Mito绿色和MITO的秘密红图像的治疗方法

平均强度数据图:处理过的Jurkat细胞

在健康的Jurkat细胞中,JC-1在线粒体中形成聚集物,导致强烈的红色荧光信号。在线粒体电位被破坏的细胞中,JC-1不形成聚集物,因此观察到的红色荧光非常少。

Cellometer采集每个样品的多个图像,并输出细胞荧光强度并在FCS Express中进行分析。数据被绘制成绿色和红色荧光强度的直方图。红/绿平均荧光强度的下降(从对照的552.29下降到处理的39.18)是线粒体去极化的标志。

Caspase 3/8活性检测

半胱天冬酶3/8概述

在非凋亡细胞中,前蛋白酶8和前蛋白酶3是不活性的半胱氨酸蛋白酶。细胞凋亡激活后,procaspase-8与活化的caspase-8蛋白酶发生信号级联。Caspase-8能迅速将procaspase-3转化为活性Caspase-3。一旦caspase-3被激活,一系列不可逆的事件就会启动,导致细胞死亡,包括CAD (Caspase-Activated DNase)内切酶的激活,该内切酶降解细胞核内的DNA并引发染色质凝结。

CaspGLOW™Fluorescein Active Caspase-3或Caspase 8染色试剂盒提供了一种简单、灵敏的检测活细胞中活性Caspase-3/8的方法。在检测Caspase -3时,我们使用了一种特定的fitc偶联的Caspase -3抑制剂DEVD-FMK(或Caspase 8的IETD-FMK)。这两种抑制剂,DEVD-FMK和IETD-FMK都是细胞可渗透的,并且不可逆地结合到凋亡细胞中活性的Caspase -3或Caspase - 8。抑制剂上的荧光标记(FITC)可用于检测细胞凋亡。

蜂窝荧光强度数据被绘制为每个样品的直方图。相关数据表显示Caspase(+)的细胞百分比,以及Caspase( - )的细胞群的百分比。

半胱天冬酶3积极

已对处理的Jurkat细胞进行成像,并导出到FCS Express软件的数据。苹果酶信号的平均强度被绘制为直方图,以确定治疗的Jurkat群体的阳性百分比和百分比。

处理过的Jurkat细胞的明亮视野和Caspase图像

Caspase阳性活性数据图

细胞群 %的细胞 浓度(x 10^6 Cells/ml)
全部的 100.00 2.80
半胱天冬酶+ 57.44 1.61
半胱天冬酶- 42.36 1.18

半胱天冬酶3 -

对照Jurkat细胞成像,数据导出到FCS Express软件。caspase信号的平均强度绘制成直方图,以确定对照Jurkat种群的阳性百分比和阴性百分比。

对照Jurkat细胞的明亮视野和Caspase图像

Caspase负活性数据图

细胞群 %的细胞 浓度(x 10^6 Cells/ml)
全部的 100.00 4.52
半胱天冬酶+ 30.04 1.36
半胱天冬酶- 69.84 3.15

细胞凋亡检测

在4个简单步骤中检测细胞凋亡

使用Cellometer K2或Vision CBA,只将20µl的样品添加到Cellometer计数室。样品的成像和分析在30秒内完成。可以查看明亮的视野和荧光细胞图像,以检查细胞形态和验证细胞计数。细胞总数,浓度和平均直径自动显示。

1.将20µl的样品移液到一次性载玻片中。

2.将幻灯片插入仪器

3.从下拉菜单中选择分析

4.点击计数,获取图像并查看细胞计数,浓度,直径

结论

Circometer图像细胞仪是一种稳健的系统,能够通过多种方法检测细胞凋亡。通过检测Caspase 8,Caspase 3和JC-1可以测量早期的凋亡事件。凋亡级联激活的下游后果是将磷脂酰丝氨酸的易位转移到细胞膜的外叶子,其中可以通过膜蛋白V检测。最后,可以通过碘化丙啶检测通过细胞凋亡和坏死的细胞。

使用Cellometer检测细胞凋亡的出版物

  • Berger EA, McClellan SA, Vistisen KS, Hazlett LD. (2013) HIF-1α对铜绿假单胞菌角膜炎中PMN的有效杀灭、抗菌肽的产生和细胞凋亡至关重要。PLoS病原体9 (7)
  • Verma M, Shulga N, Pastorino JG。(2013) Sirtuin-3调节Bak/Bax依赖性凋亡。细胞科学杂志126 (1): 274 - 88
  • Yedjou CG, Saeed MA, Alamgir Hossain M, et al.(2012)人工合成azammacrocycle诱导人肝癌(HepG(2))细胞基本凋亡和坏死细胞死亡。环境毒理学28(8)9
  • 陈丽玲,赖宁,王爱玲,等(2011)利用Cellometer成像细胞术快速检测细胞凋亡和坏死。细胞凋亡16 (12): 1295 - 303