临床主要样品中的准确细胞计数和可存活率测量

免疫学简介

免疫学领域包括许多不同的研究领域,因此具有非常广泛的主要样品。在这里,我们概述了研究人员在日常基地检查的一些重要样本。它们的范围从人的初级和临床样品中从小鼠模型固定到固定细胞样品中的细胞样品。

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尽管有各种各样的临床和初级样本,但大多数情况下浓度和活力是由单一的方法确定的:使用台班蓝血细胞计数。这种计数方法不一定适用于所有样品。骨髓、脐带血、组织消化液、支气管肺泡灌洗和其他初级和临床样本可能被残留的红细胞、组织和细胞碎片污染。这些污染物会导致免疫细胞计数不准确。

Nexcelom的解决方案是使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶进行荧光的细胞分析。由于AO和PI是核酸染料,它们将仅结合并仅标记生物和死亡细胞的DNA。该方法允许识别,枚举,以及在任何样品中提供核细胞的细胞活力。

复杂初级样品中有核细胞检测的策略

直接测量使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色和Cellometer自动细胞计数器总有核细胞

  1. 用AO / Pi染色样品,1:1比例
  2. 将20μl染色的细胞样品进入计数室
  3. 计数,并使用Cellometer自动荧光生存能力计数器分析样品(自动2000,K2,视觉)

主要测量细胞样本的细胞浓度和存活率

量化4个简易步骤电池样品用荧光活力计数器

使用具有双荧光Cellometer - 自动2000,K2或视觉 - 仅有20微升样品加入到Cellometer计数室。样品的成像和分析在少于60秒内完成。可以观察明场和荧光细胞图像以检查细胞形态并验证细胞计数。自动显示总细胞计数,浓度和平均直径。

1.移液管20μl样品到一次性载玻片中。

2.将滑块插入仪器

3.从下拉菜单中选择分析

4.点击计数,获取图像和视图细胞计数,浓度,直径

使用Cellometom Auto 2000检测免疫细胞样品

操作简单,界面友好Cellometer程序

点击编辑按钮来改变这种text.1。移液器20μL2.插入幻灯片3.选择分析和点击计数
4.结果在30秒!

人类临床样品

骨髓(BM)

骨髓(BM)是一种复杂的组织,是造血和b细胞发育的场所。多能的非造血干细胞,如间充质干细胞,可以从人骨髓中分离出来。此外,通过稀释骨髓样品并进行密度梯度分离,可以分离出骨髓单核细胞(MNCs)。离心后,收集MNC层,通过细胞分选进一步分离各种亚群(造血祖细胞、间充质干细胞、CD33+髓系细胞和CD138+浆细胞)。

当前的问题:与红血细胞样品污染可导致免疫细胞的准确计数。

目前的解决方案:在细胞计数之前Lyse红细胞。

Nexcelom解决方案:进行基于荧光的分析。使用AO / PI允许识别,单核细胞的识别,以及在计数样品中提供细胞活力。

可以对骨髓样品进行处理并用于许多不同的实验应用,例如研究造血细胞分化途径,并作为BM恶性研究的对照。cf欧洲杯竞猜

AO法测定骨髓总有核细胞

与aopi染色的被隔绝的单核细胞

骨髓干细胞与AOPI含有

在一个单独的实验中,三个单独的人骨髓样品用AOPI染色,成像和分析。采集到的亮场(BR)图像与采集到的AOPI (F1F2)图像分别计数。如表(右)所示,在BR中被计数的粒子要比F1+F2中多得多。由于F1F2的到BR计数不为1:1,FL / BR比率反映这些计数。此外,在三个独立的实验的制表比被示为从实验来实验不同。的比率变化是在明视场非成核粒子的成像的直接结果。由于样品的复杂性,我们的结论是骨髓样本中计数有核细胞应该使用AOPI染色来进行。

F1F2. 布尔 FL / BR比率 可行性
MNC-BM_1 3296. 4575. 0.72 98.20%
MNC-BM_2 1388 1605. 0.86 98.60%
MNC-BM_3 2008年 2935. 0.68 98.20%

脐带血(CB)

脐带血(CB)在输送含有防凝结剂的250毫升标准血袋时被收集。CB-单核细胞(MNC)可通过稀释脐带血样品并进行密度梯度分离来分离。离心后,将MNC层被收集,并且可以被进一步处理以用细胞分选分离物亚群(造血祖干细胞,CD34 +中性粒细胞,CD14 +单核细胞,CD19 + B细胞,CD3 +,CD4 +,CD8 + T细胞和CD56 + NK细胞)。

脐带血样品可以被处理并用于许多不同的实验应用,如治疗造血,遗传和SCID(重症联合免疫缺陷)的病症。cf欧洲杯竞猜

用AOPI测量脐带血活细胞和死细胞总数

与aopi染色的被隔绝的单核细胞

骨髓茎与AOPI染色的细胞

5例脐带血标本用AOPI染色并成像。采集到的亮场(BR)图像与采集到的AOPI (F1F2)图像分别计数。如表(右)所示,在BR中被计数的粒子要比F1+F2中多得多。FL与BR的比值表明,在几乎每个样品中,BR中计数的颗粒数量是AOPI的两倍多。比值的变化是由在亮场中计数非核化粒子引起的。我们的结论是,在复杂的样本中,如脐带血,有核细胞计数应该使用AOPI。

F1F2. 布尔 FL / BR比率 可行性
MNC-CB_1 2488 4659 0.53 98.10%
MNC-CB_2 2613 7152. 0.37 94.10%
MNC-CB_3. 2313. 5791 0.40 93.30%
MNC-CB_4 1939年 3449. 0.56 96.70%
MNC-CB_5 2243 6450. 0.35 95.80%

人外周血(又名全血)

人外周血(又名全血)被从患者采集到含有抗凝结剂的小瓶。全血是一个丰富多样的单核细胞的来源。核细胞(祖细胞,B细胞,T细胞,树突细胞,自然杀伤细胞,中性粒细胞,红血细胞,血小板,单核细胞,巨噬细胞)亚群可被分离并使用各种隔离技术纯化。

脐带血样本可以处理并用于许多不同的实验应用,如:不同疾病的早期检测工具,研究新陈代谢和免疫途径,以及发现潜在的治疗性抗体。cf欧洲杯竞猜

AO测定全血有核细胞总数

分离的单核细胞与AO彩绘

AOPI染色CD19+ B细胞

隔离中性粒细胞的细胞用AOPI彩绘

NK细胞CD56+ AOPI染色

HPC(人造血细胞)

HPC(人造血细胞)的人造血初级细胞来自外周血,骨髓或脐带血分离得到。

CD34 +干与AOPI染色的细胞

鼠样品

鼠原代细胞。小鼠动物模型被广泛用来研究不同的人类疾病。种类繁多的样品定期收集和处理。获得细胞计数和活力是有标准的实验室实践的一部分两种常见的方法。

当前的问题:在标准的收成,许多样品的处理非常耗时。此外,由于有很大各种潜在的样品可能需要多个方法来确定细胞计数和活力。

目前的解决方案:血细胞计数器计数。

Nexcelom解决方案:进行基于荧光的分析。使用AO / PI允许识别,枚举,并在收集的样品中提供核细胞的细胞活力。可以对许多不同收集的样本进行该过程。

进行了大规模的免疫学研究,其中收集了30个单独的小鼠淋巴细胞样品和脾细胞并在同一天加工。每个样品用AO / PI染色并使用A成像Cellometer Auto 2000..获得所有样品的细胞总数、浓度和活力。

Lym7 Lmy6 Lym2 淋巴5
总细胞数 49. 1419 10635. 24245
活细胞浓度 1.07 e + 05 2.84E + 06 3.11e + 07. 6.75E + 07
可行性 63.20% 58.00% 84.40% 80.30%
明场细胞图像
计算活/死细胞图像

以上,是代表性的一组4个不同的小鼠淋巴细胞样品(Lym7,6,2,5)。明场和一个计数荧光图像示出了用于每个样品。将样品在浓度范围为1.07.X105.(计算49个细胞)到6.75×107.(共计数24245个细胞),存活率为58.0% ~ 84.4%。由于在数据采集过程中可以保存图像,因此可以将它们用于记录计数单元格并进行可视化验证。

下面,是含有对于每个30的收集和处理的淋巴细胞和脾细胞的样品中的数据的表。以下是报道的细胞计数,浓度和活力的活细胞。相同的成像及数量参数用于所有样品。总的成像时间为所有60个样品是使用血细胞计数器相比总计数时间约30分钟,约2小时。

样品编号 细胞计数 浓度 可行性
ln 1.
5627
1.94E + 07
83.60%
Ln 2.
9283
3.20e + 07
84.30%
LN 3.
11694
4.03 e + 07
83.20%
LN 4.
8320.
2.87 e + 07
82.90%
LN 5.
21310.
7.35E + 07
81.60%
LN 6.
608.
2.09E + 06
49.90%
LN 7.
19.
6.55E + 04
52.70%
LN 8.
5944
2.05E + 07.
81.50%
LN 9.
1383.
4.78E + 06
71.60%
ln 10.
3968
1.37E + 07
75.20%
LN 11.
1641
5.66E + 06
69.90%
LN 12.
12408.
4.28E + 07
84.90%
LN 13.
1456.
5.02E + 06
76.40%
LN 14.
2168
7.47E + 06.
76.30%
LN 15.
3912.
1.35E + 07
80.30%
LN 16.
3876.
1.34E + 07
80.00%
LN 17.
3836
1.32E + 07
79.80%
LN 18.
2008年
6.92 e + 06
70.60%
LN 19.
1940年
6.68E + 06.
68.50%
LN 20.
1535
5.29E + 06
66.90%
LN 21.
2103
7.25E + 06
72.00%
LN 22.
9048
3.12E + 07
80.30%
LN 23.
2607
8.99E + 06
71.80%
LN 24.
8240
2.84E + 07
79.10%
LN 25.
3571
1.23E + 07
75.50%
LN 26.
10520
3.62E + 07.
81.80%
LN 27.
6069
2.09E + 07
82.40%
LN 28.
5913
2.04E + 07
74.50%
LN 29.
6457
2.22E + 07
74.00%
LN 30.
6296.
2.17 e + 07
78.40%
样品编号 细胞计数 浓度 可行性
Sp 1
3840
1.32E + 07
58.40%
Sp 2
6322
2.18E + 07
64.80%
Sp 3
4055
1.40E + 07
63.60%
Sp 4
4990.
1.72E + 07
58.70%
Sp 5
8204.
2.82E + 07.
62.80%
Sp 6
7704.
2.65E + 07
60.20%
Sp 7
8209.
2.83E + 07
79.90%
Sp 8
8999.
3.10E + 07
59.90%
Sp 9
7870.
2.71E + 07
69.30%
SP 10
7894.
2.72 e + 07
69.30%
SP 11
3967
1.37E + 07
63.80%
SP 12
2659
9.19 e + 06
72.30%
SP 13
1329
4.58E + 06
61.40%
SP 14
1290
4.45E + 06.
60.60%
SP 15
2215.
7.64 e + 06
60.70%
SP 16
2222
7.66E + 06
60.60%
SP 17
5199.
1.79 e + 07
70.50%
SP 18
1895
6.53E + 06
74.40%
SP 19
1769
6.09E + 06
60.50%
SP 20
3532.
1.22E + 07
59.50%
SP 21
1972年
6.79E + 06
67.70%
SP 22
1764
6.08E + 06
62.40%
SP 23
2020.
6.96E + 06
64.60%
SP 24
1156.
3.98E + 06
64.90%
SP 25
1244.
4.28E + 06.
60.00%
SP 26
3884
1.34E + 07
76.70%
SP 27
1728
5.96E + 06
69.80%
SP 28
2136.
7.36E + 06
65.10%
SP 29
2112.
7.29E + 06
67.90%
SP 30
1080.
3.72 e + 06
65.70%

鼠尾静脉取血

小鼠淋巴结

小鼠树突细胞

鼠标消化耳

小鼠脾细胞

肿瘤文摘

消化样品从在肿瘤的主要来源的患者收集。首先需要实体瘤被消化和处理它们可以在实验中利用之前。

当前的问题:组织消化是天生的凌乱样本。它们可能含有组织碎片和细胞碎片,这使得识别和计数感兴趣的细胞变得困难。

目前的解决方案:纺出的碎片和洗样品多次。的通过磁珠分离技术的兴趣分离细胞。

Nexcelom解决方案:进行基于荧光的分析。AO / PI染色允许识别,计数,并提供了所收集的样品中的有核细胞的细胞存活力。

肿瘤消化的实例

人黑色素瘤样品消化沾上AOPI

明亮的现场图像,AO / PI图像和明亮场和AO / PI叠加图像

小鼠肿瘤文摘的样品用AO / PI染色

明亮的字段和AO / PI叠加图像(右右侧)仅显示核心细胞的标记。

肿瘤细胞与淋巴细胞

明场,并用AO彩绘淋巴细胞与肿瘤细胞混合物的荧光图像/ PI

将淋巴细胞添加到肿瘤细胞的悬浮液中并用AO / PI染色。获取样本数据并自动分析图像。细胞直径直方图表明我们的样品中有两个不同的群体:一种(以红色)的直径较小〜6.0微米,另一个(绿色)是肿瘤细胞平均直径约13微米。

支气管肺泡灌洗(BAL)

Bronchoalveolar灌洗(BAL)是一种医疗程序,其中支气管镜通过口腔或鼻子进入肺部,流体被喷射到肺的一小部分中,然后回忆检查以进行检查。BAL样品可含有肺和支气管上皮细胞,巨噬细胞,淋巴细胞和其他免疫细胞。来自人或小鼠的BAL样品可以在Cellomet上分析。

当前的问题:BAL样品中含有细胞碎片使其难以识别和计数感兴趣的细胞。

目前的解决方案:在分离和纯化免疫细胞后,流式细胞术或手动计数用于计数细胞。

Nexcelom解决方案:进行基于荧光的分析。使用AO / PI允许识别,枚举,并在收集的样品中提供核细胞的细胞活力。

支气管肺泡灌洗样品的实例

这些小鼠BAL样品从多个独立实验中收集。每个样品用AO染色并成像。以上是亮场,AO荧光(FL),以及BR-FL叠加图像的集合。

计算PBMC样品

  • 外周血单核细胞的分析类似于骨髓,脐带血或全血的核细胞分析
  • 使用血细胞计数器和光学显微镜可包括供体依赖性RBC诱导的计数误差电流PBMC枚举法
  • Cellometer图像流式细胞仪是用来消除由自动RBC诱导的计数误差枚举AO / PI染色的核细胞

了解更多关于Cellometer PBMC分析»

结论和Cellometer选择指南

临床初级样本通常用于生物学、免疫学和癌症研究。样品的多样性和数量经常给计数和计算样品浓度和活力提出了一个挑战,以有效和准确的方式。Cellometer系列仪器为研究人员提供了多种工具,以执行快速和一致的有核细胞计数。即使在潜在污染物存在的情况下,血液和初级样品的荧光染色也可以准确识别和枚举有核细胞。下面的图表提供了一个快速的参考指南,Cellometer可能适合你的实验室!

给我们一个电话978-327-5340。经历Nexcelom应用专家可cf欧洲杯竞猜上午8:30至下午5:30协助选择Cellometer系统。

Cellometer迷你 Cellometer汽车T4 Cellometer自动1000 Cellometer Auto 2000. Cellorom Vision / Vision CBA
纯化细胞 - 无杂物
孤立的MNC - 没有裂解RBCS
新鲜的BM,CB,WB,MNCs W / RBCS的裂解
新鲜BM, CB, WB,未溶解
冷冻BM,CB,WB
消化的肿瘤和组织/细胞碎片

=优秀=非常好=好的=不推荐的BM =骨髓,CB =脐带血,WB =全血,MNCs =单核细胞

问一名专家

出版物使用Cellometer的免疫学研究

  • 辛格H,Figliola MJ,道森MJ,等人。重新编程CD19特异性T细胞与IL-21信号传导可以提高B-谱系恶性肿瘤的过继免疫疗法。癌症研究2011年,15(10):3516-27
  • 陈LL,钟XM,皮拉尼A,林B.一种用于使用基于图像Cellometer术稀有细胞增殖的动力学测量新方法。免疫学杂志2012方法,377(1-2):8-14
  • Holmuhamedov EL,柴尔尼C,比森CC,Lemasters JJ。乙醇禁止显示尿素生成在大鼠肝细胞:乙醛的作用。生物化学杂志2012,287(10):7692-7700
  • Ranguelova K, Rice AB, Khajo A, Triquigneaux M, Garantziotis S, Magliozzo RS, Mason RP。人中性粒细胞活化亚硫酸盐衍生自由基的形成:一项ESR研究。中国生物医学工程学报,2012,29 (4):529 - 534
  • 作者简介:Lugli E, Gattinoni L, Roberto A, Mavilio D, Price DA, Restifo NP, Roederer M. human and nonhuman灵长目T干细胞记忆细胞的鉴定、分离和体外扩增。自然学报,2012,8(1):33-42
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  • Chan Lly,Laverty DJ,Smith T,Nejad P,Hei H,Gandhi R,Kuksin D,血压使用图像细胞术进行外周血单核细胞浓度的精确测量,消除RBC诱导的计数误差。中国免疫学方法2013,388(1-2):25-32
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