肝细胞

肝细胞概述

肝细胞是肝脏的主要细胞,约占肝脏细胞的60%,占肝脏肿物的80%。肝细胞呈片状排列,分支、吻合或相互连接。大多数肝细胞有一个单核,但双核细胞也很常见。每个肝细胞大约有1000个线粒体。约15%的细胞体积由光滑和粗糙的内质网组成。每个细胞约有30个溶酶体和500个过氧化物酶体。肝细胞的主要功能之一是产生胆汁。肝细胞还负责调节代谢、解毒和重要循环蛋白的制造,使其成为肝病、药物代谢和毒理学研究的关键组成部分。

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肝细胞是肝脏的主要细胞,约占肝脏细胞的60%,占肝脏肿物的80%。肝细胞呈片状排列,分支、吻合或相互连接。大多数肝细胞有一个单核,但双核细胞也很常见。每个肝细胞大约有1000个线粒体。约15%的细胞体积由光滑和粗糙的内质网组成。每个细胞约有30个溶酶体和500个过氧化物酶体。肝细胞的主要功能之一是产生胆汁。肝细胞还负责调节代谢、解毒和重要循环蛋白的制造,使其成为肝病、药物代谢和毒理学研究的关键组成部分。

准确肝细胞计数的重要性

在药物筛选过程中,原代肝细胞通常被用来衡量候选药物的毒性。大多数细胞毒性试验是基于板的试验,包括在每个孔中电镀肝细胞。精确和准确的细胞浓度和活力测量是获得可重复性、高质量数据的关键。

多井板

多孔板用于筛选药物候选物以反复测量的不同浓度,产生大量数据点进行分析和比较。

为了正确解释数据,需要在多孔板上播种已知生存能力的相同数量的细胞。

肝细胞挑战和Cellometer解决方案

由于肝细胞的可变形态,脆弱性和丛生的倾向,传统的手动计数方法可能是耗时和不准确的。因为肝细胞随着时间的推移失去活力,所以扩展或可变计数时间可以产生不准确和不一致的活力测定。肝细胞太脆弱,不能使用流动诱导的剪切应力来使用流式细胞术评估。

双荧光染色程序

对于活力测定,将20μl肝细胞样品与20μLViaStainTM AO / Pi染色溶液混合。吖啶橙(AO)染料在所有核细胞中染色DNA,产生绿色荧光,易于将肝细胞与碎屑区分开来。碘化丙啶(PI)用损伤的细胞膜染色了所有细胞中的DNA,产生红色荧光。在用AO和PI染色的细胞中,通过FRET(荧光共振能量转移)通过红色荧光吸收绿色荧光,因此所有死肝细胞都能荧光红色并且可以容易地计算。该过程快速,温和,准确。

细胞图像流式细胞术是测定肝细胞浓度和活力的理想方法,克服了肝细胞的所有困难特性:

肝细胞的挑战 Cellometer解决方案
脆弱的 非流体成像系统
不规则的形状 不规则(非圆形)形状的特殊计算算法
变量的大小 用户可调整大小范围计数
形成群集或团块 专有Cellometer软件识别和计数集群中的单个细胞
随着时间的推移失去活力 分析时间小于60秒

明亮的场地图像和互联网和PI计数叠加

Cellometer Instruments自动捕获和分析多个图像。计数的活细胞以绿色概述,而数量的死细胞以红色概述。

使用这种方法,使用Cellometer Vision成功地计算了许多物种肝细胞,包括以下内容:

  • 人类

  • 老鼠

  • 虹鳟鱼

  • 猴子

  • 兔子

可以分析更多物种

用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)测定细胞浓度和活力

混合后立即将20μl染色样品加载到槽计数室中并插入Cellomet计仪器。样品直接从计数室成像。由于计数室是一次性的,所以样品之间不需要洗涤,并且没有交叉污染的风险。使用预先设定的原发性肝细胞进行成像并分析样品。可以观察明场和荧光细胞图像以检查细胞形态并验证细胞计数。自动显示总细胞计数,浓度和平均直径。

AO / PI协议

  1. 获取Nexcelom AO/PI溶液:访问我们的试剂页面
  2. AO/PI溶液1:1染色细胞
  3. 载荷计数箱滑动并分析

1.将20µl的样品移液到一次性载玻片中。

2.将幻灯片插入仪器

3.从下拉菜单中选择分析

4.点击计数,获取图像并查看细胞计数,浓度,直径

自动化可行性结果

明亮视野和荧光肝细胞图像

亮场图像(左)显示原发肝细胞的不同形态。双荧光图像(右)显示已计数的活肝细胞(绿色圈出)和已计数的死肝细胞(红色圈出)。

Cellometer肝细胞活力结果

细胞图像和数据可以立即保存到一个安全的网络或直接从Cellometer软件打印。

图像和表格可以导出到Excel或PowerPoint,以便进一步分析、演示或发布。

自动分析和报告消除了计数或录制中的操作间可变性和潜在用户错误。

Cellometer软件报告:

  • 细胞计数
  • 细胞浓度
  • 细胞生存能力
  • 细胞的直径

结论

Cellometer K2愿景和视觉CBA仪器是研究人员进行原代肝细胞精确生存能力和浓度测量的理想工具。由于原代肝细胞的脆弱特性,Cellometer Image cytomometer提供了在保持细胞健康的同时测量细胞活力的最佳方法。

使用Cellometer仪器进行肝细胞分析的出版物

  • Shan J, Schwartz RE, Ross NT, et al.(2013)人类肝细胞扩张和iPS分化小分子的鉴定。Nat化学杂志9(8)514-520
  • Zhang X, Zhang X, et al. (2013) Minocycline和do西环素通过抑制线粒体钙单受体来保护肝细胞免受化学缺氧和缺血再灌注损伤,而不是其他四环素来源的化合物。Toxicol:杂志273 172 - 179
  • 王D,Li L,Yang H等人。(2013)组成型和疏野受体是一种新的治疗靶,促进基于环磷酰胺的造血恶性肿瘤治疗。121 329 - 338
  • Ashley CE, Carnes EC, Phillips GK等(2011)噬菌体MS2病毒样颗粒对不同货物的细胞特异性运送。ACS纳米5 (7) 5729 - 5745
  • Holmuhamedov El,Czerny C,Beeson Cc等。(2012)乙醇在大鼠肝细胞中抑制尿素作用:乙醛的作用。J Biol Chem.287(1)7692-7700

一般肝细胞的引用

  • Ploss,A.等人。(2010)。持续的丙型肝炎病毒感染微观粒子肝细胞培养,PNAS.107(7), 3141 - 3145。Doi: 10.1073 / pnas.0915130107。
  • Malarkey, D.等人(2005)。肝脏形态学功能方面的新见解,毒理学病理学.33:27-34。DOI:10.1080 / 01926230590881826
  • Malhi, H.等(2010)。肝细胞死亡:一个明显的和当前的危险,杂志。牧师.90:1165-1194。DOI:10.1152 / physrev.00061.2009。
  • 陆,J.-N。,et al. (2011). The Behaviors of Long-term Cryopreserved Human Hepatocytes on Different Biomaterials,人造器官.35:E65-E72。DOI:10.1111 / J.1525-1594.201010.01191.X。