急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的特征在于肺水肿,通常引起肺部衰竭或死亡。当肺内的上皮和内皮细胞具有破坏的屏障功能和流体通过并积聚时,发生ARDS。这种情况是Covid-19患者死亡的主要原因,并且没有目前的药物治愈或治疗ARDS。目前,治疗侧重于流体管理的呼吸支持。

通过研究屏障功能发现潜在的候选药物

发现潜在的药物候选人,可以治疗ARDS,体外高吞吐量筛选工具是至关重要的。确定内皮屏障功能的一种方法体外称为明确渗透性测试(XPERT)测定(图1)。荧光标记的抗生物素蛋白暴露于在板上的孔上生长在一层生物素化明胶上生长的汇合细胞单层。当标记的抗霉素通过细胞层时,它与生物素结合并粘在底部(图1)。使用像这样的图像细胞计数Celigo.允许通过细胞屏障的荧光标记的细胞同时检测和量化。将内皮细胞造型在肺部中研究其障碍功能,Dubrovskyi等人。使用人的肺动脉内皮细胞(HPAEC)形成单层细胞,然后通过测量胞质剂上的绿色荧光量来定量阻隔功能。

表达渗透性测试

图1:使用XPerT测定内皮屏障功能。用生物素化明胶包被细胞培养板测量横向扩散。首先,内皮细胞(EC)在生物酰化的明胶涂层上生长。然后将荧光素标记的生物素(fitc -亲和素)添加到细胞培养基中短时间内。未结合的fitc亲和素被洗掉,细胞被甲醛溶液固定。通过FITC荧光区显示和量化渗透系数。

Celigo是一种完整的图像细胞分析仪,自动获取微孔板在亮场和四个荧光通道的图像。在亮场,细胞的形态响应某些分子的变化可以被检测到。此外,我们可以确定细胞单层是否被破坏,以排除在分析。在荧光绿色通道中,测量融合百分比,以查看有多少fitc -亲和素能够通过细胞屏障。图2显示了高渗透细胞与低渗透细胞井的示例图像。

使用全孔图像细胞仪在亮场和四个荧光通道上自动获取微孔板图像

Celigo是一种完整的图像细胞分析仪,自动获取微孔板在亮场和四个荧光通道的图像。在亮场,细胞的形态响应某些分子的变化可以被检测到。此外,我们可以确定细胞单层是否被破坏,以排除在分析。在荧光绿色通道中,测量融合百分比,以查看有多少fitc -亲和素能够通过细胞屏障。图2显示了高渗透细胞与低渗透细胞井的示例图像。

高渗透率vs低渗透率

图2。96孔板表面的凝胶涂层上,fitc -亲和素与HPAEC单分子层结合的绿色荧光Celigo全孔图像。这些图像将fitc -亲和素与高通透性hpaec细胞和低通透性hpaec细胞进行了比较。

为了测试Celigo是否可以测量通透性的变化,已知的信号因子被用来影响细胞通透性。在ARDS中,已知内皮细胞旁通路调控不当。粘附连接和局部粘附连接是已知的介导细胞-细胞连接,并与肌动蛋白细胞骨架相连接。已知的信号分子如凝血酶、肿瘤坏死因子- α (TNF-a)和脂多糖(LPS)会影响屏障功能。在此,我们用这些因子处理细胞,观察Celigo如何检测细胞通透性的变化(图3)。

细胞通透性比较

图3。用XPerT方法比较(a)凝血酶、(b) TNF-a和(c) LPS处理细胞23小时后的细胞通透性。(d)随时间变化的绿色荧光图像显示,由于荧光区域所示的可溶性因素,细胞通透性发生了变化。凝血酶在0.5 - 2小时显示出较大的荧光区域,TNF-a和LPS在23小时显示出更大的荧光区域。(e) Brightfield图像显示可溶性因子引起的形态学变化(载体,圆形;凝血酶,小;TNF-a elgonated;有限合伙人,形态)。

本研究表明在其他电流方法上使用Celigo图像细胞仪的几个优点。我们不仅能够测量荧光通道的汇合,而且可以通过图像进行图像,以告知数据的解释。能够检测到单层或形态变化的任何破坏,并纳入分析中。由于可渗透区域中阈值荧光强度的能力,我们还能够提高信噪比。这种方法适用于更高的吞吐量选择,并且可以将其缩放到384孔板以测试更多分子。总的来说,Celigo是一个改善的重要工具体外并可用于发现潜在的候选药物,以帮助治疗ARDS。

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Dubrovskyi, Oleksii等,“基于图像的内皮屏障功能评估的hcs兼容方法的开发”。SLAS发现:促进药物发现的科学,卷。26,不。9月9日,2021年10月,第107-1090号,DOI:10.1177 / 24725552211030900