使用Celigo图像流式细胞仪直接计数安捷伦Seahorse™XF数据的标准化

近年来,Seahorse™XF分析仪已经勤勉地利用来测量氧气消耗率(OCR)和细胞外酸化速率(Ecar)/质子生产率(PPR)以了解能量代谢和细胞功能[1]。

执行Seahorse™XF细胞代谢分析的重要步骤之一是将结果数据标准化,以最大限度地减少由于可能在微孔板上不均匀的细胞播种而导致的井间不一致和差异。一般来说,常用每孔总蛋白量进行归一化,如BCA测定[2]。

基于蛋白质的归一化方法存在一些已知问题

  1. 由于在测定期间使用的代谢抑制剂,细胞在测定期间可能会丢失
  2. 使用总蛋白分析对Seahorse™数据进行归一化是耗时的
  3. 它需要多个步骤,例如细胞裂解,孵育和转移裂解含量以进行分析
  4. 洗涤和转移程序可以引入细胞丢失或移液误差等风险,从而偏斜最终规范化的结果
  5. 整个96孔板的BCA测定时间可达45分钟

另一种提高Seahorse™XF标准化的方法是在代谢应激测试之前,对每口井进行直接细胞计数。

直接基于细胞计数的归一化方法消除了蛋白质分析中的问题

  1. 单元格计数是一种非破坏性方法,用于生成Seahorse™归一化数据
  2. 它可以考虑跨井和跨板的播种密度不均匀
  3. 标准化后仍可进行下游测定
  4. 直接的细胞计数可以显著减少执行规范化所需的时间

使用Celigo图像cytometer进行整体井直接电池计数

近年来,Celigo图像细胞仪已被用于对Seahorse™XF数据归一化进行Seahorse™XF数据标准化进行明亮的场或荧光直接电池[3]。由于其高速捕获全井图像的能力;Celigo Direct Cell计数应用程序已适用于Seahorse™XF96,XFE96和XF24分析仪的一般工作流程。

Celigo Image Cytometer提供了一种快速、有效、无压力的细胞计数技术,用于计数未涂层或涂层培养板上的细胞。该系统包含Seahorse™板的内嵌板轮廓,将在~4-5秒内获得96孔板的完整孔图像,整个板的分析在明亮视野中为~6分钟,在荧光中为~9分钟。

Celigo Image Cytometer可用于在明亮视野下直接计数悬液和贴壁细胞,以及荧光如Hoechst 33342或Live-nuclear dye染色。亮场和荧光方法都可以有效地用于归一化Seahorse™XF数据。

使用活核染料(Nexcelom Bioscience)可以发乐动体育-南安普顿合作伙伴出更亮的荧光信号,并且几乎没有细胞毒性和细胞动力学效应。此外,细胞识别算法对悬液或贴壁细胞的分割具有很高的准确性,无论是明亮视野还是荧光成像。荧光活核染料可提高对贴壁细胞计数的准确性,贴壁细胞贴壁后趋于平坦。

此外,Celigo在全孔中有很大的动态计数范围,即在96孔板中,悬浮细胞每孔计数1 ~120,000个细胞,贴壁细胞每孔计数1 ~90,000个细胞。

全井图像-从海马XF板

图。1Celigo从Seahorse™XF井中用3个柱子拍摄的全井图像。准确的直接细胞计数显示在绿色圈出的细胞,红色表示不包括柱。

Seahorse™XF归一化的基于亮场的直接细胞计数方法

在该实验中,评估糖酵解功能(Ecar)的DCIS和HCT116细胞系约160分钟。使用Celigo图像细胞仪对蛋白质量和明场单元进行标准化Seahorse™XF数据。然后比较了归一化时间依赖的eCAR数据,其显示使用细胞计数标准化的细胞系分化的改善。

  1. 在Seahorse TM XF 96孔板中分别在12,500个细胞/孔/孔和10,000个细胞/孔中接种DCIS和HCT116细胞,并孵育过夜
  2. 第一次在显微镜下观察到约95%的融合
  3. 然后使用Celigo在98%的98%处确认汇合,以及在洗涤之前的细胞健康,形态,种子均匀性和纯度(无污染)的QC
  4. 然后,用适当的化验介质清洗
  5. 随后,在Celigo上使用直接细胞计数应用对平板进行成像和分析
  6. 接下来,将培养皿置于37°C无CO2培养箱中45分钟
  7. 然后用Seahorse XFe96对平板进行分析,测量ECAR,持续160 min
  8. 最后用该平板进行蛋白分析,进行归一化处理

Celigo捕获的亮场图像显示在图1中,其中显示了Seahorse™XF井的完整井图像,包含3个柱。此外,放大后的图像显示了HC116细胞的精确直接计数(绿色轮廓),并排除了post区域(红色轮廓)。

通过利用Celigo软件中的图形功能和井掩膜特性,研究人员可以按井内特定面积的百分比计数细胞,这可能使Seahorse™XF数据更好地归一化(图2)。

标准化后的ECAR时间依赖数据用于蛋白质和细胞计数的标准化如图3所示。很明显,用蛋白标准化测量无法区分DCIS和HCT116细胞株的糖酵解功能。相比之下,细胞计数归一化法的标准差降低,DCIS和HCT116细胞株的ECAR值明显分离。

娇碧的绘图和井掩码功能

图。2Celigo软件的图形和井掩模功能允许细胞计数在井面积的特定百分比。

图。3归一化ECAR时间依赖数据用于蛋白和细胞计数归一化。

基于荧光的Seahorse™XF归一化直接电池计数方法

在该实验中,对T细胞评估了线粒体呼吸(OCR)和糖酵解功能(Ecar)约60分钟。使用Celigo图像cytometers归一化Seahorse™XF数据与蛋白质量和荧光细胞计数。然后比较归一化终点Ecar数据,其显示使用细胞计数归一化的药物反应分化的改善。

  1. T细胞在Seahorse™XF 96孔板中以100,000细胞/孔的速度播种
  2. 让细胞沉降到平板底部
  3. 然后将平板放入Seahorse™XF分析仪中,并允许Hoechst 33342的交付,随后进行60分钟的分析
  4. 然后在Celigo上计数总Hoechst阳性细胞
Celigo Hoechst计算细胞图像

图。4Celigo捕获亮场图像(左),放大合并亮场和Hoechst图像(中),黄色ROI计数的Hoechst染色细胞(右)。

Celigo门移去海马柱

图。5使用Celigo Gating功能,生成位置图以在使用荧光的井中将3个帖子(上面用红色箭头指示)出口。另外,如果分析了3个帖子之间的区域(用红色方形显示),则扫描和计数每平仅需要2分钟。

标准化端点海马数据

图6。标准化的ECAR终点数据用于蛋白和细胞计数的标准化。

Celigo捕捉到的亮场和Hoechst荧光叠加图像如图4所示。计数图像显示黄色轮廓,表明计数的Hoechst阳性细胞。同样,在门控函数下,可以生成位置图,使用荧光将井中的3个柱门出(图5)。

蛋白质和细胞计数归一化的归一化Ecar端点数据如图6所示。类似地,蛋白质和细胞计数标准化方法显示出不同的结果。使用蛋白质标准化,可以观察到每个样品的大标准偏差,以及莫名药物治疗趋势。另一方面,细胞计数归一化显示标准偏差的降低,以及显示预期药物治疗导致Ecar的降低,因为药物浓度增加。

速度的结果

Celigo图像细胞仪可以使用明场和荧光成像(图7),每96孔板(每孔小于4和5秒),直接扫描全阱图像并直接计数小于6和9分钟)(图7)。如果仅捕获3个帖子之间的区域,则整个过程只需要2分钟。使用Seahorse™XF分析仪调查线粒体呼吸和糖酵解功能的研究人员可以快速且有效地将OCR和Ecar测量结果迅速地标准化,而无需额外的程序,如蛋白质分析。

Celigo粘附和悬浮工作流程

图。7Celigo工作流为粘附和悬浮细胞。

全井图像和图像质量

图像质量是Celigo图像细胞仪的一个关键优势。由于采用了F-Theta透镜和Galvanometric Mirror的组件,Celigo在亮场和整个平板的荧光中都能产生高度均匀和快速的整体良好成像。因此,推断从一个单一的形象是不必要的中间,这可能带来不确定性和不准确的计数如果细胞不均匀播种(图8)。这些图片还可以帮助确定问题与细胞或不正确的播种试验结果并不如预期。

不均匀细胞播种

图8。Celigo全亮场图像显示非均匀的种子细胞。

精密精确的细胞计数算法

由于细胞有各种形状和大小,研究人员还需要一个灵活和复杂的细胞计数平台,以确保标准化的准确结果。无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,都可以利用多种但特异的计数算法,在亮场图像和荧光图像上对目标细胞进行计数。此外,定位图被用于明确地排除3个post区域,以进一步提高细胞计数的准确性(图2)。

执行无标签的直接单元格计数

Celigo Image Cytometer可直接计数无荧光标记的贴壁细胞和悬浮细胞,消除对细胞潜在的细胞动力学影响,减少染色时间。然而,由于Celigo有一个亮场和4个荧光通道(蓝、绿、红和远红),基于荧光的直接细胞计数也可以很容易地进行。

参考文献

  1. “将XF代谢数据标准化为细胞或线粒体参数”,应用笔记,Seahorse Bioscience.
  2. 安捷伦海马XF数据的归一化现场使用BioTek Cytation 5 "进行细胞计数Seahorse Bioscience.
  3. 谜语et al。,“人体肌肉祖细胞的扩张能力不同的年龄,性别和代谢燃料偏好,”Am J Physiol Cell Physiol, doi: 10.1152/ajpcell。00135年,2018年
*Seahorse™XF分析仪是安捷伦的产品https://www.agilent.com/en/产品/细胞分析/seahorse-analyzers
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