内化和吞噬作用

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受体内化试验通过内吞作用测定细胞膜受体进入细胞的吸收。配体与表面受体的结合激活了这一过程,表面受体发出了质膜形成的向内囊泡的信号,包围着目标受体(如图所示)。当囊泡形成并被内化后,它们被重新定向与早期核内体(pH 6.0-6.5)融合,这些核内体可以将受体回收回质膜,或者它们可以被晚期核内体和溶酶体(pH 4.5-5.5)降解。

传统上,受体内化活细胞分析可以通过荧光显微镜定性检测,观察荧光标记的受体,如Fc和g蛋白偶联受体(GPCRs)。此外,western blot还可以用来量化受体内化的水平。然而,这些方法是耗时的,需要经验丰富的研究人员获得有意义的结果。

通过使用Celigo成像细胞仪,可以成像抗体或荧光蛋白标记的受体,测量靶细胞群的荧光强度以自动测定受体内化水平。

Celigo成像血细胞计数

Celigo操作

  1. Celigo在微孔板上的全部井
  2. 对捕获的图像进行分析
  3. 每个分析的样本都会自动输出结果

实验方法

  1. 靶细胞(THP-1)以2×10接种4.24孔板中的细胞/孔(Greiner 662160)
  2. 细胞Fc受体用IgG-Dylight-488或IgG-Phrodo标记,一种pH敏感染料,可在酸性环境中氟(内体和溶酶体)
  3. 实验孔中的细胞用化合物A处理,该化合物A应促进受体内化
  4. 对照孔中的细胞用化合物B处理,该化合物B不应促进受体内化
  5. 然后将细胞孵育24小时
  6. 孵育后,用Celigo扫描板并分析以测量%内化

受体内化荧光图像

受体内化的成像

荧光图像显示化合物A处理的细胞中受体内化率很高。

当诱导受体的囊泡与晚期内体和溶酶体融合时,发生绿色荧光。

使用celigo捕获的亮场图像计算细胞总数,同时计算荧光图像以确定显示内化的细胞数量。

然后按#荧光细胞/总数计算内化%。

使用Celigo成像细胞仪进行%内化的量化

量化的内化

量化的内化

与对照化合物B相比,用化合物A处理的细胞显示出高%的受体内化。

此外,与Dylight-488相比,Phrodo荧光表现出更高的%内化。

结论

Celigo流式细胞仪可通过荧光检测检测受体内化率。

捕获多孔微孔板中的明场和荧光图像的能力自动允许基于高通量的细胞的测定。

此外,直接在板上分析粘附细胞消除了对胰蛋白酶化的需求并消除对细胞的破坏。

吞噬作用的介绍

吞噬作用

吞噬作用是免疫系统的重要过程,以消除细胞碎片和病原体。它是一种特定形式的内吞作用,涉及膜质内化。吞噬细胞如巨噬细胞可以吸引到病原体或细胞碎片上,并吞噬材料被捕获在称为吞噬体的内囊泡中。吞噬蛋白酶将与溶酶体融合以形成吞噬组体,其中酶和毒性过氧化物可以在低pH值下消化病原体或细胞碎片。吞噬作用的宿主防御活化是通过将哺乳动物免疫细胞附着到病原体相关的分子模式(PAMP),这可以导致NF-κB活化。

传统上,可以通过标准光学显微镜定性检查吞噬作用的活细胞分析,观察细菌或细胞碎片的吞吐。此外,还可以通过用血清或IgG结合的颗粒孵育吞噬细胞来定量测量吞噬作用。温育后,将过量的颗粒洗掉,仅留下吞噬颗粒的吞噬细胞。将这些细胞裂解并释放吞吐物材料,然后可以通过使用微孔板读取器或蛋白质印迹分析来检查,以量化吞噬作用的水平。然而,这些方法是耗时的,需要经验丰富的研究人员获得有意义的结果。

通过使用Celigo成像细胞仪,可以使用pH敏感标签pHrodo来测量吞噬作用。标签只有在pH值较低的吞噬酶体中才会发出荧光。因此,通过测量荧光量或细胞荧光百分比,可以使用Celigo确定目标细胞群的荧光强度和测量吞噬水平。

Celigo成像血细胞计数

Celigo操作

Celigo操作
  1. Celigo在微孔板上的全部井
  2. 对捕获的图像进行分析
  3. 每个分析的样本都会自动输出结果

实验方法

  1. 靶细胞(THP-1)在24孔板(GRENER 662160)中以2×10 4个细胞/孔接种
  2. 用LPS刺激细胞以分化为巨噬细胞
  3. 将细胞孵育24小时
  4. 将两种化合物加入到孔中,化合物A诱导吞噬作用,化合物B是对照
  5. 然后将细胞与用Phrodo标记的颗粒混合,pH敏感染料可以荧光酸性环境(内体和溶酶体)
  6. 然后将细胞孵育24小时
  7. 孵育后,用Celigo扫描板并分析以测量%内化

吞噬曲线增多型Phrodo荧光图像

Dextran Phrodo吞噬作用的图像

Dextran Phrodo吞噬作用的图像

荧光图像显示,化合物A处理后,右旋糖酐凝胶绿色荧光细胞的百分比很高。

荧光图像也显示,当用化合物B(对照)处理时,右旋糖酐pHrodo绿色荧光细胞的百分比很低。

当用Dextran Phrodo标记的颗粒被吹入吞噬体并与溶酶体融合时,发生绿色荧光。

使用celigo捕获的亮场图像计算细胞总数,同时计算荧光图像以确定显示内化的细胞数量。

然后通过#荧光细胞/总计计算%吞噬作用

使用Celigo成像细胞仪进行%吞噬作用的量化

量化吞噬作用

量化吞噬作用

与对照化合物B相比,用化合物A处理的细胞显示出高%的吞噬作用。

结论

Celigo成像细胞仪可通过荧光检测右旋糖酐pHrodo染料测定细胞吞噬率。

捕获多孔微孔板中的明场和荧光图像的能力自动允许基于高通量的细胞的测定。

此外,直接在板上分析粘附细胞消除了对胰蛋白酶化的需求并消除对细胞的破坏。