直接杀伤NK细胞

自然杀伤细胞介导的细胞毒性的定量分析

  1. 测定靶细胞裂解率
  2. 灵活使用纯化的或在pbmc中的NK细胞
  3. 通过NK细胞产生直接靶细胞的BF和FL图像
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直接杀伤NK细胞的无毒钙黄素AM释放试验

典型的NK细胞介导的杀灭涉及辅助信号传导或相互作用以诱导NK细胞活化和下游细胞毒性。NK细胞可以通过抗原呈递细胞和/或多种细胞因子来激活。

NK细胞被病原体激活

直接杀伤NK细胞的方法有两种。首先,经过基因工程纯化的NK细胞能够识别、结合并杀死目标肿瘤细胞。二、IL-2进一步刺激含有NK细胞的人PBMCs,以诱导更强的激活并促进靶细胞的杀伤。

传统上,细胞毒性测定采用铬-51释放法、乳酸脱氢酶释放法、荧光素酶报告基因测定法和荧光释放法(下文介绍)。

检测方法 描述 现有的问题
放射性释放 测量释放或放射性标签,51铬、101.在上清液中 处理有害物质;间接测量细胞死亡
荧光释放 测定上清液中钙黄素AM荧光分子的释放 细胞死亡的间接测量;端点检测只
LDH释放 测定上清液中胞质酶的释放 细胞死亡的间接测量;端点检测只
荧光素酶报告实验 在细胞死亡时测量荧光素酶 间接测量细胞死亡
流式细胞术 测量样品中可活细胞和活力的数量 不能在盘子上表演;贴壁细胞必须胰蛋白酶吗

或者,通过将靶肿瘤细胞与无毒,非放射性钙蛋白酶标记,我们可以通过进行免疫效应细胞来通过进行Calcein AM释放测定来监测肿瘤细胞的杀伤。

自然杀伤细胞介导的细胞毒性的定量分析

Celigo实验协议

  • 使用IMR32(粘附剂)和K562(悬浮液)靶细胞来证明使用Calcein AM染色用于直接细胞计数的NK细胞介导的细胞毒性检测方法
  • 收集靶细胞(贴壁细胞和悬液细胞),用钙黄素AM染色
  • 靶细胞接种于96孔微孔板中
  • 效应细胞以不同的E:T比率(10:1,5:1,2.5:1,1.3:1,0.6:1,和0.3:1)加入孔中。
  • 使用Celigo扫描并分析孔,用于指数Calcein AM染色靶细胞
    • 将效应细胞加入靶细胞后4小时成像不同E:T比值的细胞
    • 进行时间课程(T = 1-4小时)以通过监测Calcein AM染色靶细胞的还原来确定细胞毒性百分比
    • 最大释放使用TRITON X100来粘合所有细胞并释放Calcein AM荧光分子

实验板图

实验板图

制备两种靶细胞系IMR32和K562。添加不同E:T比值的效应nk细胞。

E:T比值和时间依赖性细胞毒性的K562和IMR32

K562 IMR32的细胞毒性

代表性的4小时亮场和钙黄素AM覆盖图像显示E:T比值依赖的细胞杀伤。钙黄素am标记的靶细胞在对照图像中没有被杀死,而几乎所有的靶细胞在5:1效应靶细胞样本中被杀死。

细胞裂解率的计算

细胞毒性测定的裂解计算

  • 效应细胞孔中活靶细胞(钙黄素AM阳性)计数
  • 计数#的活靶细胞(Calcein AM阳性)在没有效应细胞的孔中(控制)

领唱消散方程

E:T比值依赖NK细胞介导的细胞毒性(T = 4小时染色的K562细胞成像)

K562细胞用Calcein染色

钙黄素+荧光图像的例子是在t = 4小时K562靶细胞

荧光图像显示,随着E:T比值的降低,钙黄素AM阳性靶细胞数量增加

E:T比依赖性NK细胞介导的细胞毒性结果

裂解百分率图靶细胞

百分率裂解图显示E:T比值对靶IMR32和K562细胞的影响。不经胰蛋白酶化的Celigo直接测定活贴壁IMR32细胞。t = 4小时时的钙素AM阳性细胞数计算每个E: t比值的裂解百分率。

时间依赖性NK细胞介导的细胞毒性(NK细胞:K562细胞比(E:T)= 2.5:1)

NK细胞介导的细胞毒性

使用Celigo图像细胞仪直接测量活K562悬浮细胞。每小时计算Calcein AM阳性细胞的数量,并用于计算每个E:T比的裂解百分比

时间依赖性NK细胞介导的细胞毒性结果

百分比裂解情节

百分率裂解图显示E:T比值对靶IMR32和K562细胞的影响。不经胰蛋白酶化的Celigo直接测定活贴壁IMR32细胞。在每个小时计数Calcein AM阳性细胞的数量,并使用得到的细胞数来计算每个E:T比的裂解百分比。通过分析IMR32的时间课程数据,我们可以看到E:T比率之间存在大的裂解差异。

使用IL-2刺激的NK细胞检测患者PBMC捐献样本的细胞毒性

Celigo实验协议

  • 目的细胞(K562)用5 μ M calcein AM染色30min
  • 然后将靶细胞接种在10,000个细胞/孔中的96孔板中
  • 接下来,按照平板图上的E:T比值添加效应细胞(如下图所示)
  • 最后,在一半的孔中加入IL-2来激活NK细胞
  • 在没有pbmc的k562染色细胞中可见自发释放
  • 最大的释放是在染色的靶细胞中看到的裂解剂处理
  • 加入细胞和IL-2后,将培养皿离心,使细胞沉降到培养皿底部
  • 随后,用Celigo图像细胞仪对平板进行扫描
  • 扫描在T = 1,2,3和4小时内获得
患者捐献了PBMC样本

细胞裂解率的计算

    1. 计数有和无效应细胞的钙黄素AM阳性靶细胞数
    2. 计数含和不含IL2的钙黄素AM阳性靶细胞数
    3. 归一化到t = 0

百分比解方程归一化时间为零

    1. 正常化到自发释放

百分分解终方程

  1. 计算每口井的溶解率,并进行平均,以产生剂量响应和时间过程监测

细胞毒性剂量反应

细胞毒性有反应图

在高E:T比与IL-2的比例的样品中观察到更大的溶解。总体而言,即使在较低的E:T比率下,含有IL-2的样品中的溶解百分比更大。

时间进程监控

时间过程监测曲线图

在靶标仅对所有样品中的控制上方观察到溶解百分比。与NO IL-2样品相比,具有IL-2的供体样品显示出大量的裂解。