斑块和病灶计数

高通量斑块和聚焦计数在亮场和荧光成像

  1. 高通量自动成像和分析直接在印版
  2. 直接计数在没有胰蛋白酶的板中的受感染细胞
  3. 图像并在8分钟内分析96孔板
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斑块和病灶计数导论

通过自动计数斑块和焦点来量化病毒感染性的能力非常重要。为了快速和有效地确定病毒感染性,需要用病毒和宿主细胞进行多种病症或滴定。使用马萝卜过氧化物酶或荧光标记与标记或蛋白质有各种类型的斑块和焦点。这些允许开发焦点和斑块的高吞吐量计数。

协议

  1. 寄主细胞被播种并使其附着在96孔微板表面24小时
  2. 在平板上加入不同浓度或数量的病毒颗粒,测量病毒的传染性
  3. 例1:感染区可以清除宿主细胞,然后用结晶紫染色,使细胞和开口形成对比
  4. 例2:可用马萝卜过氧化物酶或荧光结合抗体或荧光病毒蛋白标记感染病灶或斑块
  5. 然后使用Celigo图像cytometer进行成像和分析宿主细胞样本,以计算斑块和焦点的数量

在6孔微孔板中直接计数病毒斑块

  1. Vero宿主细胞被播种在一个96孔的微孔板上,并使其粘附过夜
  2. 准备了三种不同浓度的病毒颗粒并将其添加到宿主细胞中
  3. 样品允许孵育48小时
  4. 孵育后,宿主细胞用晶体紫色染色,露出病毒斑块(清除区)
  5. 最后,用Celigo流式细胞仪对平板进行成像分析,计数斑块数量

整个井亮明亮的场和数量的图像

完整的亮场和计数斑块图像

例如,亮场图像显示了6孔板中病毒斑块的计数

放大明亮的视野和计数图像

放大明亮的场和计数斑块图像

放大示例亮场图像显示6孔板中的斑块计数

96孔板上马萝卜过氧化物酶反染色的病毒诱导斑块的高通量定量

  1. 寄主细胞被播种在一个96孔的微板上,并让其粘附过夜
  2. 不同的病毒颗粒被制备并添加到宿主细胞中
  3. 样品允许孵育24小时
  4. 在孵育后,用一抗病毒蛋白抗体和结合马萝卜过氧化物酶(HRP)的二抗标记感染灶
  5. 最后用Celigo流式细胞仪对培养皿进行成像分析,计数感染斑块的数量

不同病毒形成的斑块的亮场和计数图像

不同病毒形成的斑块的亮场和计数图像

例如,亮场图像显示HRP阳性感染斑块计数

96孔板上流感感染Vero细胞荧光斑的高通量定量

  1. vero宿主细胞在96孔微型板中接种并使其粘附过夜
  2. 流感病毒颗粒的5倍滴定被制备并添加到宿主细胞中
  3. 样品允许孵育24小时
  4. 孵育后,用偶联Dylight 488的一级病毒蛋白抗体标记感染病灶
  5. 最后用Celigo流式细胞仪对培养皿进行成像分析,计数感染细胞的数量

例荧光图像显示Dylight 488阳性感染细胞计数

荧光图像显示Dylight 488阳性感染细胞计数

Dylight的488个阳性细胞的百分比被计数,生成如下所示的感染曲线,并将结果直接与手工计数进行比较,手工计数只覆盖了10%的孔

流感感染疫源地

流感感染的病灶数据
日志10(洁净/毫升) Celigo 手册
整洁的 8.97 9.03
1:10 8.05 8.03
1:10 7.99 7.90
1:100 6.97 6.99.
1:100 6.99. 7.04

Celigo显示出对手动计数方法的高度相当的斑块计数结果。

96孔板上流感感染Vero细胞荧光斑的高通量定量

  1. Vero宿主细胞被播种在96孔微板中,并使其粘附过夜
  2. 制备2倍滴定的GFP甲型流感病毒颗粒并加入到宿主细胞中
  3. 将标本孵育24小时,用Celigo图像细胞仪进行成像和分析,计数感染细胞的数量

每次稀释后感染荧光斑的完整荧光图像

感染荧光斑的完整荧光图像

顶部图像显示在Celigo图像细胞仪上捕获的荧光病毒斑块的整体井成像。为每种病毒稀释度捕获整个井图像,提供了病毒感染的全部井。

采用菌落法直接在绿色荧光通道中计数感染的荧光斑

斑块直接计入绿色荧光通道

顶部的一排显示了Celigo捕捉到的病毒荧光斑的放大图像。中间一行是Celigo软件分析过的病毒空斑。识别出的斑块由软件自动圈出。下面一行显示的是亮场和荧光图像的叠加。Celigo软件允许从多个通道叠加多个图像,只需点击一个按钮。

荧光斑计数结果

荧光斑计数结果

一旦病毒斑块被成像并由Celigo计算,所有数据都会导出到Excel以进行进一步分析。病毒斑块的数量绘制在病毒的表现稀释系列上。该数据表明,病毒斑块的数量与每个井添加的病毒量直接相关。