用于临床样品的细胞浓度和活力

介绍浓度和存活率

在临床样品中测定存活力和有核细胞的浓度是本来就很难由于红血细胞(红细胞)和细胞碎片的存在。在试图除去污染红细胞,临床样品,如外周血单个核细胞,骨髓和脐带血常规经历RBC裂解或聚蔗糖梯度分离。但即使是这些方法并不总是成功地消除所有的红细胞和确定细胞浓度时直接导致显著的错误。通过使用Cellometer双荧光法,如下所述,我们消除了RBC裂解和聚蔗糖梯度的需要。因此,我们可以测量所有主要的临床样品的生存力和浓度,而不需要从样品中除去红细胞。

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Cellometer双荧光计数方法

为了测定的可活力测定,将20μl样品与20μLCTOR计AO / PI染色溶液混合。吖啶橙(AO)染料在所有核细胞中染色DNA,产生绿色荧光。碘化丙啶(PI)用损伤的细胞膜染色了所有细胞中的DNA,产生红色荧光。在用AO和PI染色的细胞中,通过FRET(荧光共振能量转移)被红色荧光吸收绿色荧光。所有死核细胞荧光红色(图像远右侧)。所有活成核细胞荧光绿色(图像右)。在荧光图像中计数活和死细胞。

红细胞(RBC),血小板和碎片不荧光,并且不包括细胞计数,因此AO / PI活力法不需要样品溶解。

AO / PI染色细胞图像

TNC活力的新鲜临床标本

新鲜临床样本的细胞图像

因为新鲜的临床样品含有非常高的血小板和红细胞,因此有时不评估进入样品的TNC浓度。在一些实验室中,样品裂解用于TNC分析,但不能确定细胞活力。

Cellometer AO / PI双荧光方法可用于容易测量新鲜临床样品中的TNC浓度和活力,例如骨髓,脐带血和外周血而不会裂解。

AO / PI分析步骤:

  • 用PBS稀释骨髓,脐带血或外周血样品1:10。
  • 将20μl稀释样品与20μLAO/ PI染色溶液组合。
  • 加入20μl染色的样品到Cellometer计数室和插入件插入和插入的成Cellometer自动细胞计数器作为Cellometer自动2000,Cellometer K2或Cellometer视觉CBA等。
  • Cellometer系统自动捕获并分析光盘和荧光图像。
  • 自动数据报告提供细胞计数,浓度和平均直径与用于样品的%生存力沿着两个活的和死的有核细胞。

新鲜骨髓抽吸分析结果

明场像

所有细胞

绿色荧光图像

活成核细胞

红色荧光图像

死核细胞

数据报告

新脐带血分析结果

明场像

所有细胞

绿色荧光图像

活成核细胞

红色荧光图像

死核细胞

数据报告

新鲜外周血分析结果

明场像

所有细胞

绿色荧光图像

活成核细胞

红色荧光图像

死核细胞

数据报告

报告会在屏幕上自动显示。与图像A打印的报告可直接从Cellometer软件生成

MNC和PBMC分析

通过密度梯度分离去除RBC和血小板后,使用台盼蓝染色来手动计算样品以计算存活率。因为样品可以含有在密度梯度分离后的不同量的RBC污染,所以在该阶段使用AO / PI双荧光法用于样品的样品提供提高的精度和再现性。

AO / PI分析步骤:

  1. 将20μl样品与20μLAO/ PI染色溶液组合。
  2. 加入20μl染色的样品到Cellometer计数室和插入件的成Cellometer自动细胞计数器如Cellometer自动2000,Cellometer K2或Cellometer视觉CBA。
  3. Cellometer系统自动捕获并分析光盘和荧光图像。
  4. 自动数据报告提供细胞计数,浓度和平均直径与用于样品的%生存力沿着两个活的和死的有核细胞。

PBMC样本分析结果

明场像

所有细胞

绿色荧光图像

活成核细胞

红色荧光图像

死核细胞

数据报告

如下面所示,可以有在下面的密度梯度分离样品RBC污染。

使用AO / PI方法消除了通过计数RBC而引起的潜在误差。

在PBMC样品中染色核细胞

PBMC样品中存在的RBC在用Cellometer Vision 10x仪器(远留)获取的明场图像中可见。因为RBCS不含DNA,因此它们不被AO染色,并且不计为绿色荧光图像中的活成核细胞(靠近左侧)。

RBC污染的影响

RBCS未被AO / PI染色,并且不通过Cellometer软件识别

红血细胞看起来像在显微镜下的白血细胞。手动计数跨国公司时,它们通常可以包括在内。

PBMC明亮的场地图像

血小板,白细胞,红细胞和可以识别并与Cellometer视觉仪器带到测量样品中红细胞的污染量的图像计数。

RBC污染是目前的关注密度梯度分离

在评价15个随机PBMC样品,4个样品显示出高程度的RBC污染和6个样品显示中等RBC污染。

RBC污染存在于MNC和PBMC样品中。

RBC污染量从一个样品到另一个而变化。

手动计数在使用RBCS中高估PBMC计数和活力

对于含有高RBC污染的样品,手动计数超过估计的WBC浓度〜25%至50%。

AO / PI细胞计数与实际PBMC计数紧密相匹配。

AO / PI与RBC污染的样品提供了一种更精确的PBMC浓度和存活率。

纯化临床样品分离的细胞群分析

在免疫磁性分离后,样品显示出高纯度,并且可以使用各种计数方法精确计算,包括台盼蓝和AO / PI。无论是从骨髓,脐带血或外周血中分离,分离的细胞群通常都是非常干净的,没有RBC或血小板污染。下面示出了从不同类型样品中分离的特异性细胞群的几种实例。它们的外观都非常相似。点击此处查看CD34 +视频的Cellometer AO /分离的细胞群的PI分析的演示。

来自NPB的CD56 + NK细胞

CD34 +干细胞的CB

来自NPB的CD19 + B细胞

AO / PI相关手动计数的临床标本

作为与协作的一部分ALLCELLS,质量主要细胞的提供者,Nexcelom科学家将两个流行的明亮场计数方法与Cellometer AO / PI双荧光计数进行了比较。结果对亚甲基蓝计数方法(所有样品类型)和台盼蓝计数方法(用于隔离的细胞群)相关性。

很强的相关性,以手工计数使许多实验室来实现变化以最小的文档和测试的Cellometer AO / PI计数方法。

AO / PI和亚甲蓝TNC计数密切相关的新鲜样品

裂解/染色了十六个样品(外周血,脐带血和骨髓抽吸物)3%乙酸/亚甲蓝和手动计数。

用染色每种样品的第二等分试样AO / PI没有裂解并与之计算Cellometer Auto 2000.

虽然3%乙酸/亚甲基蓝色方法提供精确的TNC计数,但它不测量细胞活力。

的AO / PI方法不需要的细胞裂解。

台盼蓝和AO / PI计数适用于纯化的样品

台盼蓝和AO / PI 24个纯化样品(CD14 +,CD19 +和CD34 +细胞)之间良好的相关性

6个MNC样品无相关性为好。台盼蓝计数由于RBC污染较高。(红圈)

台盼蓝或AO / PI可以用来精确地测量在分离的细胞群,例如CD34 +,CD56 +,和CD19 +细胞浓度和存活率。

Cellometer细胞计数的好处

  • 探讨含有红细胞,血小板和碎片的样品的性能
  • 对于新鲜的分析和处理的临床样品,而无需裂解一个优化的双荧光法
  • 用于对纯化样品进行传统的台盼蓝或双荧光活力测定的选择
  • 证明与传统计数方法的相关性
  • 改进的精度及数量的结果的一致性
  • 自动保存和打印结果和图像
  • Nexcelom应cf欧洲杯竞猜用专家专注于细胞计数和细胞检测
  • Cellometer细胞计数器已被用来计数超过1600种不同的细胞类型
  • Cellometer细胞计数器使用前十名制药公司和所有40个NCI综合癌症中心
  • 免费在线和现场培训和客户支持