准确计数外周血单个核细胞并在不溶解红细胞的情况下测量存活率

外周血单个核细胞(PBMC)简介

处理外周血单个核细胞(PBMC)样本可能很棘手。目前,许多用户使用血细胞仪和光学显微镜手动计数PBMC。然而,标准光学显微镜无法一致区分白细胞和红细胞(RBC)。因此,这种手动方法可能导致过度报告样品的浓度和活性测定。此外,红细胞的双凹形状只能通过特殊的光学装置、聚焦技术和训练有素的操作员来识别。另一个挑战往往是不同样本的红细胞和血小板污染程度差异很大。这增加了有一组条件快速简单地计算和衡量生存能力的难度。

PBMC细胞计数挑战综述

  • 大量用户仍然使用血细胞仪和光学显微镜手动计数外周血单个核细胞

  • 标准光学显微镜无法一致区分白细胞和红细胞

  • 红细胞的双凹形状只能通过特殊的光学装置、聚焦技术和训练有素的操作员来识别

亮场图像

样本差异大

不同样本的红细胞和血小板污染程度不同,因此很难有一套条件来快速简单地计数和测量存活率。

准确计数和生存能力的重要性

外周血单个核细胞用于检测免疫功能。检测包括增殖、细胞毒性和细胞因子的产生。在临床试验和生物医学研究中,使用冷冻保存的外周血单个核细胞是至关重要的。

在癌症免疫治疗中,白细胞分离通常用于从患者血液中分离免疫系统细胞。然后根据疫苗设计,细胞被扩增或暴露于不同的试剂中。然后将活性细胞输回患者体内。细胞浓度和活力是整个制造过程中监控的基本参数。

Ficoll通常用于从骨髓、外周血和脐带血中分离单核细胞。单核细胞和淋巴细胞在血浆层下形成一层棕黄色的外壳。收集细胞并清洗。通常,一些残留的血小板或红细胞混合在单核细胞中。

冷冻保存的PBMC的功能测定与细胞的活力有关。为了获得可靠的功能分析结果,应在临床试验中使用生存能力阈值。

PBMC实验的特点

  • 细胞质量随时间下降
  • 大量样本通常与临床试验相关
  • 细胞样本不纯净,分离质量取决于患者样本和操作人员

活PBMC浓度和存活率是细胞分离、处理和冷冻保存的常规测量方法

  • 细胞分离用标签磁珠
  • 用于荧光活性细胞分类和分析的抗体标记和染色
  • 加入冷冻鸡尾酒前的冷冻保存
  • 解冻后的质量控制

获得准确的PBMC细胞计数的选择

单样本细胞计数器
高通量细胞计数器

消除红细胞计数误差的方法

新鲜人外周血单个核细胞中残留红细胞的鉴定

方法:

使用荧光纤维计自动细胞计数器对样本进行成像,并手动计数红细胞和白细胞

程序:

  1. 用移液管将20µl新鲜样品移入一个纤维计一次性细胞计数室
  2. 使用仅亮场成像方法设置玻璃纤维计
  3. 调整焦点以确定红细胞的双凹形态
  4. 从计数室的4个位置捕获细胞图像
  5. 打印细胞图像
  6. 手动枚举具有和不具有双凹面形态的细胞。血小板不被计数,细胞尺寸小得多。

红细胞溶解后PBMC样本中残留的红细胞

从捕获的亮场图像手动识别红细胞(红色圆圈)和白细胞(蓝色圆圈)。在PBMC样本的手动计数过程中,这些残留RBC可能导致计数不准确。

15份新鲜人PBMC样本的结果:

  • 4份样本显示红细胞高度污染(大于30%)
  • 6个样本显示中度红细胞污染(10%至30%)
  • 5个样本显示红细胞污染程度低或无污染(低于10%)

红细胞污染%=红细胞计数/总细胞计数(x100)

15份PBMC样本的红细胞污染数据

15份新鲜人PBMC样本中具有和不具有双凹形态的细胞数量。这清楚地表明,残留红细胞的数量因样品而异,从0%到50%不等。

不溶解红细胞的PBMC样品的精确双荧光分析

Nexcelom优化了双荧光染色法,用于简单、准确地测定浓度和活力。用AO/PI染色的样品可以用赛洛米自动2000大提琴计K2使用预优化设置进行PBMC分析的仪器。

吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)是荧光核酸染色剂,用于测量各种细胞类型中的有核细胞活力,包括哺乳动物细胞系、哺乳动物原代细胞和酵母。

  • AO是一种膜渗透染料,可将有核活细胞染成绿色。
  • PI是一种膜不渗透染料,可将膜受损(无活性)有核细胞染色为红色。
  • 不能存活的细胞实际上被AO和PI染色。由于荧光共振能量转移(FRET),AO荧光能量被转移到PI,使非存活细胞只能发出红色荧光。
  • 溴化乙锭可以代替碘化丙啶

未经红细胞裂解的AO/PI染色样品

活PBMC 死PBMC 红细胞/血小板
吖啶橙(AO)染色 阳性绿色斑点 阳性绿色斑点 无污渍/无污渍
碘化丙啶(PI)染色 没有污点 阳性红染色 无污渍/无污渍

因为血小板和成熟红细胞没有细胞核,所以它们不会被核染色染料染色。

使用双荧光法,红细胞、血小板或碎片的计数没有误差。红细胞溶解是不必要的。

外周血单个核细胞中的红细胞和血小板

虽然亮场图像显示存在红细胞,但它们未被Cellometer软件染色或计数

AO/PI双重染色法测定总有核细胞数的验证

A.使用AO/PI染色和Cellometer自动细胞计数器直接测量有核细胞总数

  1. 用AO/PI按1:1的比例对样品进行染色
  2. 将20µl染色细胞样品装入计数室
  3. 使用荧光纤维计细胞计数器对PBMC样品进行计数和分析

B.从样本中计算总核数

  1. 用3%乙酸溶解同一样品15分钟,以释放细胞核
  2. 用台盼蓝(TB)染色细胞核
  3. 在光学显微镜下使用血细胞仪手动计数台盼染色的细胞核

样品制备

C.使用AO/PI比较台盼染色细胞核总数与直接测量的有核细胞总数

  1. 对样本进行计数。结果显示AO/PI染色的PBMC和台盼蓝染色的细胞核计数相当,表明AO/PI染色的细胞是有核PBMC。

计数结果

AO/PI法与手工白细胞计数法PBMC计数的比较

A.使用AO/PI染色和Cellometer自动细胞计数器直接测量有核细胞总数

  1. 用AO/PI(20ul细胞样本+20ul AO/PI)染色新鲜人样本
  2. 使用荧光纤维计细胞计数器对样品进行计数和分析
  3. 记录AO/PI单元计数和样本ID
  4. 将AO/PI与图2中报告的白细胞计数进行比较

B.将AO/PI细胞计数与之前进行的红细胞和白细胞计数进行比较。

后果

所有样本的AO/PI和手动计数之间可获得可比较的白细胞计数。(绿色条和蓝色条的长度相等)

使用手动方法和AO/PI方法的细胞计数之间的差异等于每个样本的红细胞数量。

结论AO/PI染色可以消除人工计数法中残留红细胞引起的误差。

AO/PI和手动计数之间的可比白细胞计数

AO/PI分析性能–计数范围、重复性和一致性

使用新鲜PBMC测量细胞浓度线性和浓度

  • 使用PBS连续稀释制备样品
  • 用吖啶橙和溴化乙锭混合物(或AO/PI混合物)在每次稀释时对样品进行染色
  • 为每个稀释装载10个玻璃纤维计计数室
  • 使用荧光纤维计细胞计数器测量活/死细胞浓度和存活率
  • 从2×10的活细胞浓度测量7.到2×105..
  • 变异系数范围为3.5%至14.1%,在可接受范围内。

PBMCs稀释系列显示R的线性关系2.= 0.9991

PBMC稀释系列结果

稀释系数 活细胞(细胞/ml) 标准(n=10) %简历
1. 2.2E+07 7.6E+05 3.5
0.5 1.1E+07 3.4E+05 3
0.25 5.0E+06 2.4E+05 4.8
0.125 2.6E+06 1.6E+05 6.2
0.0625 9.7E+05 5.3E+04 5.4
0.03125 4.1E+05 5.6E+04 13.9
0.015625 2.1E+05 2.9E+04 14.1

AO/PI法测定新鲜PBMC存活率的时间过程

新鲜样品在4°C下储存。在第1天、第4天和第7天,使用以下程序在每个时间点取出细胞样品进行活力测量:

  • 用吖啶橙和溴化乙锭混合物(或AO/PI混合物)染色细胞
  • 为每个稀释装载10个玻璃纤维计计数室
  • 使用荧光玻璃纤维计细胞计数器测量活力

当新鲜PBMCs样品储存在4°C时,生存能力随着储存时间的延长而降低。

PBMC细胞计数中纤维计的选择

  • 双荧光分析是一种优越的PBMC细胞计数方法,当与自动细胞计数器一起使用时,可产生简单准确的结果。

  • 这个Cellometer Auto 2000细胞活力计数器,大提琴计K2,纤维光度计光谱图像细胞仪系统,以及Cellaca MX为准确分析冷冻前和冷冻后红细胞污染样品中的外周血单个核细胞进行了优化。这两种系统也可用于在Ficoll分离前测定新鲜血液样本中TNC的浓度和活性。

  • Cellometer亮场电池计数器,包括迷你大提琴,自动T4自动1000,可用于准确测定培养的PBMC的台盼蓝活性。

  • 它们还可用于分析新鲜和冷冻保存的PBMC样本,这些样本在RBC裂解后进行分析。
迷你大提琴 自动纤维测定仪T4 赛洛米自动1000 赛洛米自动2000 大提琴计K2 纤维计光谱
培养的PBMC–无碎片
培养的外周血单个核细胞-碎片
新鲜外周血单个核细胞(含红细胞裂解)
未溶解的新鲜外周血单个核细胞
冷冻外周血单个核细胞

=非常好很好好的=不推荐

结论

目前使用血细胞仪和光学显微镜的PBMC计数方法可能包括供体依赖性红细胞引起的计数错误。

采用Cellometer图像细胞仪,通过自动计数AO/PI染色的有核细胞,消除红细胞引起的计数误差。

比较PBMC细胞计数的荧光细胞计数器»

工具书类

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