血小板

血小板介绍

血小板通常用于研究血液疾病中的凝血因子。因此,血小板的凝血因子和性质具有心血管和输血药物的显着意义。由于它们的尺寸(〜2微米),它们很难想象和计数。通过用Calcein AM染色它们,多个Cellometer仪器(X2,K2,Vision 10X,Vision和Auto 2000)可以识别,图像和计算它们。

问一名专家
请求报价

Calcein AM(Calcein乙酰氧基甲基酯)是细胞可渗透的非荧光化合物。在穿过细胞膜时,Calcein Am通过活细胞内通过细胞酯酶迅速水解。水解切割AM组,将非荧光钙蛋白AM转化为强绿色荧光浓度。因为所产生的calcein更亲水它被捕获在细胞内,完整膜。不具有活性细胞质酯酶的细胞不能将Calcein AM转化为Calcein,因此不荧光绿色。这允许快速且易于检测样品中的代谢活性细胞。

Calcein Am

疏水(容易被细胞吸收)

内源性细胞内酯酶

Calcein.

亲水性(用完整的膜保留在细胞的细胞溶胶中

由于Calcein AM不需要DNA结合,因此它染色所有代谢活性细胞,并且可用于测量非核细胞中的代谢活性,例如血小板12。由于Calcein AM是光稳定的,具有低细胞毒性,并且不影响细胞功能,因此是一种流行的染色,用于检查细胞活力和代谢活性。

用于全血血小板测量的测定方案

Calcein AM试剂的制备

  1. 移液管2μlCalceinAm进入18μlDH2O.现在是Calcein AM解决方案a。通过吸移到至少15次来混合。

血小板染色程序

  1. 通过将5μl血小板样品加入85μl1×PBS来稀释血小板样品。通过上下移液,混合良好。
  2. 加5μlCalcein AM解决方案a到45μl稀释的血小板样品。
  3. 将样品轻轻移移十倍,然后在黑暗中在37℃下孵育20分钟。
  4. 孵育20分钟后,样品准备分析。
  5. 通过向上和向下移液,将电池样品轻轻混合,然后将20μL加载到Cellomomer计数室中并插入Cellomet计仪器。
  6. 等待60秒的细胞在腔室中沉淀
  7. 将样本键入样本ID文本框中的名称
  8. 将稀释因子设置为20。

检测用Calcein AM染色的酶活性血小板

稀释的全血样的明亮的田间图象

Calcein的荧光图像是染色细胞

Calcein am染色细胞的荧光计数图像

结果

通过用Calcein染色完成计数完成,通过用Calcein染色细胞来测量细胞样品的活力,Cellometer软件会自动报告Calcein AM活跃的计数细胞的总数,以及细胞的浓度。以上显示的是捕获的明亮场,捕获的荧光和来自整个血液样本的计数荧光图像。由于未染色红细胞,只有白细胞和血小板染色,因为红细胞未染色,它们不会干扰计数。在计数的荧光图像中,计数颗粒用绿色圆圈勾勒出来。在这种情况下,仅计算血小板,而用黄色圆圈勾勒出白细胞被排除在基于其细胞尺寸的计数之外。

血小板亮场检测和浓度测量

使用纯化的血小板样品分离和加工的实验室可以使用亮场成像来测量血小板浓度。该测定仅推荐用于纯化的血小板样品,没有红细胞或其他污染细胞碎片,包括富含血小板的血浆(PRP)。

纯化血小板测量的测定方案

样品制备

  1. 通过将5μl血小板样品加入95μl1xPBS来稀释血小板样品。通过上下移液,混合良好。
  2. 轻轻地将细胞样品混合,通过移液到至少十倍,然后将20μl加载到计数室中。
  3. 等待60秒的细胞在腔室中沉降。
  4. 在“示例ID”文本框中键入样本的名称。
  5. 将稀释因子设置为20。

使用明田成像测量血小板浓度

明亮的纯化血小板领域

计算明亮的场地图像

纯化的血小板测定结果

结论

使用Cellometer图像细胞术的血小板计数是含血小板的理想选择。仪器在不到30秒内测量血小板浓度的能力提高了计数效率和一致性。血小板可以用Calcein染色,以确定样品活力并测量单个测定中酶活性血小板的浓度。要确定哪种仪器最适合您,请立即联系Nexcelom专家。

使用Celletom仪进行血小板分析的出版物

  • SA Q和Hoover-Plow JL。(2011)Emilin2(Elastin Microfibril界面位于蛋白质),血栓形成的潜在改性剂。血栓形成杂志9(9):1-8
  • Panigrahi s,ma y,hong l等。(2012)新型内源配体的血小板沟状受体9的接合促进血小板高潮和血栓形成。流通研究112(1):103-12
  • Zhao Y,Malinin Nl,Julia Meller J等。(2012)CALPAIN的CONDLIN-3切割的细胞粘附和迁移调节。生物化学化学杂志287(47):40012-20

利用Calcein AM进行血小板分析的出版物

  1. Morrell CN,Matsushita K,辣椒K等。(2005)S-亚硝基化血小板颗粒胞菌病的调节。PNA 102(10):3782-7
  2. Verheul HMW,Jorna As,Hoekman K,等。(2000)血管内皮生长因子刺激内皮细胞促进血小板的粘附和活化。血液96(13):4216-21