啤酒和啤酒酵母

介绍

自动细胞计数方法可以监测整个发酵过程中的酵母浓度和活力，以确定细胞健康状况以及需要添加或重新添加的酵母数量，所有这些都有助于最终产品的质量和风味一致性[1,2,3]。通过分析酵母细胞的生理和代谢特征，操作员可以有效监控酵母的活力和活力，以达到质量控制的目的，从而影响长期储存和其他生理应激[4,5]。

传统上，亚甲基蓝被用来测量酵母的活力。使用基本的亮场显微镜，异染染色可以区分活细胞和死细胞[6,7]。重要的酵母细胞通过细胞脱氢酶将亚甲基蓝转化为无色溶液，而非重要细胞保持蓝色。因此，亚甲基蓝是一种活力和活力分析的工具，因为它可以测量酶的活性[8]。尽管这种染料被认为是酿造行业的黄金标准，但这种方法耗时且容易受到人为错误的影响，从而导致依赖用户的变化[5]。评估膜完整性、膜电位（恶酮（DiBAC4（3））、细胞内转化（1-苯胺基-8-萘磺酸镁盐（MgANS））和代谢活性（羧荧光素二乙酸酯、乙酰氧基甲酯（CFDA-AM））等原理的新型荧光染料最近已可用于分析酵母的活力和活力[1,2,5,9-15]。其他着色剂，如碘化丙啶（PI）、溴化乙啶（EB）、4′、6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和7-氨基放线菌素D（7-AAD），是膜不透性染料，仅能穿透膜受损的酵母，从而识别非活性细胞[5,10,11,13,16]。双染色法吖啶橙（AO）和PI可测定酵母活力，而CFDA-AM和PI可测定酵母活力。当AO/PI遇到非活性细胞时，由于荧光能量共振转移（FRET），荧光发射从AO转移到PICFDA-AM/PI组合导致代谢活性酵母呈绿色，非活性酵母呈橙色。这些染料极大地增强了酵母的特性，但缺乏自动化意味着它们也可能耗时h流式细胞术提供了高通量过程，但操作和维护成本高昂，需要训练有素的操作员。此外，由于没有成像能力，数据的不确定性可能持续存在。基于图像的流式细胞术系统可以通过亮场和荧光成像来缓解这些挑战，并实现自动化基于d细胞的分析，所有这些都提高了酵母研究的效率和准确性。

我们过去的研究表明，图像细胞仪能够确定生理参数，如活力、活力、糖原、中性脂质和海藻糖含量[17]。此外，我们还发现，从滞后阶段到固定阶段，酵母培养物的活力和活力测量存在显著差异。数据强调，尽管AO/PI报告的酵母是可行的，但代谢活性不同。在这里，我们进一步证明了图像细胞仪的能力，以分析酵母的生存能力和活力与多荧光染色工具的背景下，两个发酵过程中的常规执行艾弗里酿酒公司(博尔德有限公司)。我们用新鲜和热杀菌酵母混合物验证了这些方法。用各种染料和染料组合(PI、EB、DAPI、7-AAD、oxonol、mgan、CFDA-AM、AO/PI和CFDAAM/PI)对酵母细胞进行染色，并将所有结果与使用亚甲基蓝手工计数的结果进行比较。在发酵过程中，通过PI和CFDA-AM分别对细胞进行染色，测定两种特定的贮藏啤酒和麦芽啤酒酵母菌株的活力和活力。此外，该过程在啤酒厂设置证明有效地特征酵母活力和活力的整个发酵过程。我们认为，这些数据表明，这种图像细胞检测方法广泛适用于各种发酵工艺，并可能帮助酿酒商更一致地生产出最高质量的饮料产品。

材料和方法

基于图像的细胞仪视觉分析

Cellometer Vision以前曾在其他地方描述过[17-19,21]。该仪器采用亮场和两种荧光成像模式测量酵母细胞浓度和活力。每个酵母样品(20µL之间的混合物5 × 10⁵1 x 10⁷向Nexcelom计数室中添加细胞（单位：mL），并在室内四个位置拍摄亮场和荧光图像。随后通过Cellometer软件对所有图像进行分析，以计数细胞，测量荧光强度，并测量细胞形态特征，如细胞大小和圆度。

酵母细胞培养物的制备

单一的殖民地酿酒酵母将菌株EBY-100接种到装有YPD培养基的锥形瓶中。培养物在摇床上培养过夜，然后分成两根离心管，其中一根在沸水浴中加热15分钟。将新鲜培养物和热杀培养物混合，制成理论存活率为0、25、50、75、100%的混合物。

亚甲蓝分析

创建工作浓度的亚甲基蓝（0.01%w/v），并与五个理论活性为0-100%的酵母样品混合。用标准血细胞仪计数样本四份。所有结果均与图像细胞仪的结果进行比较。

细胞核酸活力染色

PI、EB、DAPI和7-AAD用5个酵母活力样本（0-100%）染色。染色后直接分析PI和EB。7-AAD和DAPI均在室温下培养5分钟，然后进行细胞计数分析。所有样品一式四份进行测量，并将结果与手动亚甲基蓝结果进行比较。

使用膜电位，细胞内转换和酶染色的可行性分析

CFDA-AM、oxonol和MgANS对5个酵母活力样本进行了0-100%的染色。将CFDA-AM在37°C下培养45分钟，并将恶唑醇和MGAN在室温下在黑暗中培养5分钟。所有样本用图像细胞仪分析，一式四份，并将结果与手动亚甲基蓝的结果进行比较。

用双染色法进行活力分析

AO/PI和CFDA-AM/PI分别对5个酵母活力样品进行0 ~ 100%染色。染色后立即分析AO/PI。CFDA-AM样品37℃暗箱孵育15分钟。所有样品都是四倍成像，并与手工亚甲基蓝结果进行比较。

此外，AO/PI结果在头对头的方法与亚甲基蓝结果在生物乙醇发酵的一个时间过程中进行了比较。酵母细胞在发酵过程的增殖、2、5、10、25、30、40、50、60和70小时收集。所有采集的标本分别用AO/PI或亚甲基蓝染色，然后分别用图像细胞仪或血球仪进行分析。比较了酵母细胞浓度和活力。

在贮藏啤酒和麦芽酒发酵过程中测定活力和活力

Avery Brewery公司使用了两种商业可用的酵母酿造菌株，一种是麦芽啤酒酵母，一种是窖藏酵母。酵母细胞在含有2-4 ppm氧气的不锈钢锥形容器中繁殖，并在10°P麦芽汁中持续曝气48小时。冷却后，将酵母细胞放入装有13.8°P麦芽汁和10.3°P麦芽汁的锥形不锈钢发酵容器中，分别用于麦芽啤酒和窖藏酵母。麦酒酵母发酵6天，淡啤酒酵母发酵14天。两种酵母菌株的初始细胞数均为1 × 106细胞/mL/°P。在整个研究过程中，每24小时用PI和CFDA-AM测量一次活力。最初的测量是在酵母从供应商到达时进行的，然后在酵母繁殖的2-3天中每天进行一次，再次是在“第一次敲除”时，酵母和麦芽汁在发酵罐中初始结合，然后在发酵过程中每24小时进行一次。然后将罐体冷却到0°C以沉淀絮凝酵母，然后在一个被称为“崩溃”的时间点准备加工和包装。每天都要进行生存能力和活力分析，直到油箱被彻底冷却。所有的样本都是从罐的中间提取的，那里有活性酵母，但不包括已经絮凝的酵母细胞，因此不再处于悬浮状态。

麦芽酒酵母的发酵保持在恒定的18°C，直到啤酒大约衰减70%，在此温度升高到22°C以允许双乙酰休息。这种温度变化发生在“最后一次淘汰”时间点后约30小时，在该时间点，将全部体积的麦汁与发酵罐中的酵母混合。冷却后，随着酵母开始絮凝，酵母细胞数量急剧下降。啤酒酵母的发酵保持在13°C，直到70%的衰减，在此温度升高到18°C以允许双乙酰休息。对于啤酒酵母而言，这种温度波动发生在发酵过程中的较晚时间，即最后一次敲除后约115小时。

图像仪分析

使用合适的FOM检测每个染色的发射波长。使用的核酸活性染色剂：VB-450-302（EX:375 nm，EM:450 nm）、VB-595-502（EX:525 nm，EM:595 nm）/VB-660-503（EX:540nm，EM:660 nm）分别用于检测DAPI、PI/EB和7-AAD。对于膜电位、细胞内和酶活性染色：VB-535-402（EX:470 nm，EM:535 nm）用于检测CFDA-AM和恶唑醇。VB-535-302（EX:375 nm，EM:535 nm）用于检测MGAN。对于双重染色法，分别使用VB-535-402和660-503对CFDA-AM/AO和PI进行染色。Nexcelom软件使用三个方程进行生存能力计算（见下文）。核酸膜完整性、膜电位和细胞内染色方法采用方程式1。酶染色活性利用方程2。在方程式1和2中，FL分别代表不可存活细胞和可存活细胞。双重染色法使用方程式3，其中FL1和FL2分别代表活细胞和非活细胞的总数。

方程1:存活率= (BR-FL)/FL x 100%
方程2:生存能力=FL/BR x 100%
方程式3：活力= FL1/(FL1+FL2) x 100%

后果

核酸染色的验证

亚甲基蓝染色酵母的亮场图像可以在图1中看到，在不同的理论活性浓度下。

膜受损酵母细胞用7-AAD、DAPI、PI和EB染色。

通过亮场计数细胞，荧光法检测非活性细胞。

每种染料的亮场和荧光图像见图2a。

图2b显示了每种染料的活力比较。每种染料之间以及理论和实验可行性之间存在高度相关性（P≥0.05).

膜电位、细胞内转化和酶染色的验证

非活性酵母用oxonol和MgANS染色，代谢活性酵母用CFDA-AM染色。

图3a显示亮场和荧光图像。Oxonol和mgan报告荧光细胞数量增加，而CFDA-AM报告相反。三种菌株均显示出相当的活力结果(图3b)，且实验和理论活力高度相关。

双重染色法

AO/PI和CFDA-AM/PI的亮场和荧光图像如图4a所示。活的和有生命的酵母细胞是假绿色，而不活的细胞是假橙色。

使用方程3，两种双重染色方法具有可比性（P≥0.05）。实验和理论可行性也高度相关（R2>0.99）。

在生物乙醇发酵的时间过程中，AO/PI和亚甲基蓝报告了高度可比的浓度和活力数据（图5）。两种检测方法的浓度（5a）和活力（5b）趋势相似，验证了核酸染色方法是否符合当前行业标准。

啤酒和啤酒酵母菌株的活力和活力

在ale和lager酵母菌株中，PI测定的整个发酵过程中的活力基本保持不变，稳定在中高90%范围内，变异系数（CV）分别为2.11%和1.27%（图6）。

活力结果显示，随着生理(如糖消耗、氧气和乙醇浓度)和机械(如温度或再循环速率)条件的变化，活力呈上升或下降趋势。

据CFDA-AM测定，在发酵罐紧急冷却之前，啤酒酵母的活力一直保持在约96%的高活力，此时活力下降至约78%（6a）。

麦芽酒酵母在繁殖期间活力很高，但经过3天的时间后，活力下降，直到读数（最后敲除）约为50%。最后一次击倒后，活力增加到约94%，直到“极限重力”，此时所有的糖都被消耗掉。当发酵罐被紧急冷却时，活力急剧下降至约10%（6b）。

啤酒酵母的初始细胞数为1.5 x 107个细胞/mL，在繁殖过程中增加了四倍，但在第一次敲除时由于稀释而减少。酵母细胞数量继续增加，甚至超过了终端重力，但由于絮凝作用，该数量再次降至约2 x 107个细胞/mL（6c）。

Ale酵母细胞浓度迅速上升至约7 x 107个细胞/mL，直到稀释至倾斜状态。在整个发酵过程中，酵母仅增殖三倍，达到3 x 107个细胞/mL，直到最终达到重力，此时高絮凝使酵母细胞数减少到约1 x 105个细胞/mL（6d）。

讨论

荧光染料对酵母活力和活力的验证

基于图像的细胞仪在整个发酵过程中对酵母的生理和代谢特性提供了快速、高效和常规的监测。

本工作验证了多种基于荧光的活性和活力方法，以对抗金标准亚甲基蓝。

所有荧光染色产生的结果与通过手动血细胞仪计数获得的结果具有高度可比性，其方式更快速，且引入的用户依赖性误差更小。

核酸染料

PI和EB非选择性地与DNA结合，极大地增强了荧光强度，但也可以产生非特异性的[20]染色。

另一方面，DAPI特异性地结合到DNA的小凹槽，但它也可以在较高浓度下染色活细胞和RNA[2]。

7-AAD特异性地与DNA内的GC区域结合，而不进入活细胞。

所有核酸染料与亚甲基蓝在每个生存百分数上测定的活性差异均小于5%(图2b)。

膜完整性，膜电位，细胞内转换，酶染色染料

在膜完整性、膜电位、细胞内转化率和酶染色方面，染色剂之间的差异也表明，在每个存活率百分比下，所有染料和亚甲基蓝之间的变异性小于5%。

在本文探索的所有方法中，PI和CFDA-AM产生的荧光强度和对比度最高。

双重染色法

在双染色方法中，AO/PI和CFDA-AM/PI也显示出与亚甲基蓝相当的活力结果。

CFDA-AM确实在添加PI时表现出降低，这表明PI可能对混合物产生未知的非特异性猝灭。因此，建议进行酶染色，而不依赖于基于PI的活性染色。

过去的研究表明，如果存活率低于70%，则亚甲基蓝是不准确的，这可能是由于发生凋亡的细胞膜不稳定[18]。

酿造发酵过程中的活力和活力

PI用于研究啤酒酵母和啤酒酵母菌株的活力和CFDA-AM活力。

这两种菌株在整个发酵过程中都表现出很高的活力（95%以上）。

然而，由于发酵过程中经历的各种环境因素，活力表现出更为显著的趋势。
这项工作证实，尽管样本中可能含有大量活酵母，但这些酵母的活力差异很大。

对于贮藏酵母，生命细胞在繁殖过程中上升到~95%，在第一次敲除时由于添加麦芽汁稀释而减少。由于容易获得的糖和氧，酵母的活力仍然很高，在发酵93小时内产生峰值。在发酵的其余时间点，生命细胞的逐渐下降可能是由于糖的消耗，乙醇的增加，和温度波动，可以促进絮凝[18]。不过，在容器冷却之前，这些酵母的活力仍然很高。

对于麦芽酒酵母来说，在繁殖过程中，生命细胞数量也会增加。最初的活力很高，但在接下来的3天里，活力下降到约50%，这可能是由于拥挤引起的压力。在沥青之后，酵母活力在发酵过程中上升到95%以上。当酵母被麦汁稀释时，细胞浓度下降。ale菌株的发酵速度比大型菌株快，活性细胞浓度和活力在最终重力下达到峰值。在末次重力作用后，絮凝开始，降低了重要细胞的浓度。

尽管这两种菌株表现出相似的活力曲线，但活力测量值却大不相同。窖藏菌株在整个发酵过程中表现出很高的活力，在黑暗中似乎没有受到生理和机械变化的影响。然而，麦芽啤酒酵母似乎受到罐条件的显著影响。

酵母的复制能力是本研究中未检测的参数之一。

结论

在这里，我们展示了图像细胞仪对酵母细胞进行多荧光活性和活力测量的能力。

这些测量是在一个完整的工业酿造过程中的一个时间过程中成功完成的。

酵母的生理和代谢特性对酿酒商至关重要，因为酵母健康状况不佳会导致饮料产品的产量和风味发生变化，因此对这些特性的监测对于确保高质量产品尤为重要。

图像细胞仪允许以高效、快速和自动化的方式实时监测这些特征，从而减少用户依赖性变化并提高准确性。

在未来的实验中，它将有助于分析独特的生长参数，如渗透胁迫，酒精含量，细胞内糖原储备，有效地传播不同的饮料品牌。

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