血球计计数误差的来源

介绍

血球计一直是实验室细胞计数的金标准。血球计在18世纪的法国首次被用于分析病人的血液样本,在过去的几百年里,血球计经历了一系列重大的发展,创造了一种比它的前辈更精确和更容易使用的现代仪器。血球计仍然是所有基于细胞的研究的组成部分,但其设计和使用中固有的错误来源仍然存在。这里将概述这些错误的来源,然后讨论如何使用自动化来消除许多潜在的缺陷。

血球计误差的来源

  1. 人为错误(人为的混合、处理、稀释、计算错误和程序错误)
    1. 在一项由5名观察者参与的研究中,由于操作误差和随机误差分别为3.12%和7.8%。3.
    2. James M. Ramsey做了一个实验来测量取样面积和稀释因子如何影响细胞计数的变化。他测试了三种面积(18、9和4毫米)2)和两个稀释因子(1:100和1:25)。cv随采样面积的减小而增大。更高的稀释因子也产生更低的cv。4
    3. 贝恩发现,如果同一个操作员计数重复的精子样本,结果的差异归因于55%的取样和移液误差和45%的腔室和计数误差。5Freund和Carol发表了额外的测量结果,表明不同操作人员之间的差异可能高达52%,而单个操作人员的差异可能高达20%。5
  2. 需要多个细胞样本计数,以确保统计的准确性
    1. 1907年,约翰·c·达科斯塔(John C. DaCosta)表示,有必要测量多滴血液样本。1
    2. Nielsen、Smyth和Greenfield得出结论,为了在血球计计数中获得10%、15%和20%的准确性,需要的样本数量分别为7、3和2,另外,每个样本分别计数180、200和125个细胞。6
    3. 1881年,里昂和托马估计血球计的标准误差为公式,其中n是计数的细胞数。
    4. 1907年,威廉·西利(William Sealy)以“学生”的名义发表了他的计数啤酒酵母的著作,他通过实验和数学建模具体计算了统计变化,得出了相同的方程公式7、8
  3. 需要均匀分布的细胞
    1. 1912年,James C. Todd将细胞的不均匀分布作为误差的来源。1
    2. 学生还指出,有两个主要的误差来源,一个是获得的酵母样品可能不能代表散装溶液,以及随机取样的误差,细胞不均匀分布在观察区域。7、8
    3. 1947年发表了一篇关于血球计分布不均导致细胞密度变化的文章。初步结果表明,离入口最近和最远的区域密度分别比平均密度低3.5%和高3.5%。9
  4. 仪器仪表和材料变化(网格,深度,盖子,缓冲器类型和移液管)
    1. 结果表明,实验计算的腔体误差和吸液器误差(CV %)分别约为4.6%和4.7%。10
    2. 在一项使用5名观察员的研究中,移液管和血球计造成的误差分别为9.46%和4.26%。3.
    3. 1961年,桑德斯和斯克里得出结论,封面位置可能会带来7.6%的差异。11
    4. 本实验通过多次稀释步骤测量每个血球计模型的CV。随着稀释步长的增加,如下模型的变异系数增大:Bürker-Türk (BT) (7.7% ~ 12%), Thoma (6.6% ~ 14.1%), Makler(19.8% ~ 23.6%)。12

血球计的问题解决

随着计算机、自动化软件、光学、荧光染料、精密制造技术以及荧光显微镜、流式细胞术和图像细胞术等现代技术的发展,自动化已经解决了血球计的许多缺陷。这边是

自动化解决:

人为错误-为了解决这个问题,自动化和机器人可以取代人工液体处理和计数操作。

抽样误差,计算的字段和单元格越多,随机误差就越低,但所需的时间也就越多。通过使用自动流式或成像细胞仪,可以在更短的时间内分析数千到数百万个细胞,从而提高效率,并最大限度地减少分析中的随机统计误差。

移液和稀释误差-这些都取决于操作人员的技术专长。通过使用自动移液器或液体处理系统,这种错误可以最小化。26

材料错误,腔室误差是由于不同品牌的血球计之间的差异,以及同一产品线内的差异造成的。这也可以通过使用自动化的细胞分析仪来解决,以增加采样和最小化随机误差。

不均匀的细胞分布-如果血球计没有正确清洗,或者盖片没有正确放置,就会产生变异。这些可以通过不使用流式细胞仪等室的细胞仪来消除。细胞样本本身是块状的,仍然难以实现自动化。而利用图像细胞仪,通过图像分析算法可以对集群细胞进行聚类,提高了细胞计数的准确性。

总结

数百年来,血球计一直是生物医学研究领域的重要工具,研究人员经过多次迭代才开发出今天使用的设备,但它仍然受制于许多不可避免的误差来源。现代自动化的使用在很大程度上消除了许多这些误差来源,提高了细胞计数的准确性和效率。

参考文献

  1. 戴维斯JD。血球计及其对进步时代医学的影响。伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校;1995.
  2. 一些十九世纪血液学的先驱。病史1971;15(1): 55 - 67。
  3. 比格斯R,麦克米伦R。一些血液学方法在常规实验室中使用时的误差。临床病理学杂志1948;1: 269 - 87。
  4. 拉姆齐JM。取样面积大小和稀释对血球计白细胞计数的影响。俄亥俄科学杂志1969;69(2): 101 - 4。
  5. 影响人类精液中精子浓度的血细胞计数的因素。生殖与生育杂志1964;8: 149 - 55。
  6. 血球计细胞计数分布:非泊松行为的意义。生物技术进展1991;7: 560 - 3。
  7. 学生。血球计计数误差的探讨。生物统计学1907;5(3): 351 - 60。
  8. 夏皮罗嗯。“细胞天文学”-细胞术的可预见的未来。血细胞计数部分2004;60: 115 - 24。
  9. 计数室中白细胞的分布。临床病理学杂志1947;1得分上以25 - 9胜过:。
  10. 用血球计估算血细胞计数的误差。美国生理学杂志1940;128: 309 - 23所示。
  11. 桑德斯C,斯凯瑞DW。特别参考经修订的英国标准规范748(1958)的血球计计数箱上的血细胞分布。临床病理学杂志1961;14: 298 - 304。
  12. 使用Bürker-Türk, Thoma和Makler计数室测定精子浓度的差异。Theriogenology2005;63: 992 - 1003。
  13. Al-Rubeai M, Welzenbach K, Lloyd DR, Emery AN。用流式细胞术快速测定细胞数量和活力的方法。Cytotechnology1997;24: 161 - 8。
  14. 广义泊松分布的检验。生物统计学杂志》1977;19(4): 245 - 51。
  15. FACSCount AF系统、改良neubauer血球计、Corning 254光度计、SpermVision、UltiMate和NucleoCounter SP-100测定公猪精液精子浓度的比较Theriogenology2006;66(9): 2188 - 94。
  16. 一种新的即时血球计的临床评价。危重病医学2000;28(4): 1185 - 90。
  17. Paulenz H, Grevle IS, Tverdal A, Hofmo PO, Berg KA。库尔特(R)计数器用于公猪精子浓度常规评估的精密度与血细胞计和分光光度计的比较。家畜繁殖1995;30.(3): 107 - 11所示。
  18. Lutz P, Dzik WH。准确计数白细胞减少血小板中的白细胞(Wbcs)的大容量血细胞计室。单采和过滤制备的白细胞减少血小板质量控制的验证和应用。输血1993;33(5): 409 - 12所示。
  19. Brecher ME, Harbaugh CA, Pineda AA。准确计数低数量的白细胞-使用流式细胞术和手动低计数室。美国临床病理学杂志1992;97(6): 872 - 5。
  20. 等。血液和血液成分中极低水平白细胞计数的流式细胞术方法。输血1993;33(3): 262 - 7。
  21. 作者简介:赵志刚,博士,副教授,博士生,主要从事造血细胞活性和浓度测定的研究。实验室血液学2004;10: 109 - 11所示。
  22. 基于快速图像的细胞计数法用于荧光活力染色方法的比较。杂志的荧光2012;22: 1301 - 11所示。
  23. 关键词:细胞计数,细胞周期,线粒体电位,免疫表型,流式细胞仪Cytom部分2011;79年,一个(7): 507 - 17所示。
  24. 陈丽英,赖宁,王恩,杨旭,林斌。一种快速检测细胞凋亡和坏死的方法。细胞凋亡2011;16(12): 1295 - 303。
  25. 基于荧光显微镜和图像分析的细胞周期自动分析。医学和生物学中的物理学1996;41(3): 523 - 37。
  26. 麦克法兰RG,佩恩AM-M,普尔JCF,汤姆林森AH,沃尔夫HS。一种红细胞自动计数装置。英国血液学杂志1959;5: 1 - 15。