血细胞仪的历史

介绍

一个多世纪以来,血细胞仪一直是血液学家、医生和生物学家必不可少的工具。根据使用地点的不同,该词有多种拼写,如hemacytometer、hemacytometer、haemacytometer或hemacytometer,但为了保持一致性,本综述将使用“hemacytometer”一词。前缀“hema”、“hemo”、“haema”或“hemo”表示血液,而“cytometer”表示测量细胞的设备。该设备最初被医生用来分析病人的血液样本,这是血液学领域的最初火花。血细胞仪在19世纪和20世纪初经历了一系列重大发展。杰克·大卫·戴维斯(Jack David Davis)[1]撰写的论文《血细胞仪及其对进步时代医学的影响》中详细描述了血细胞仪的发展。在此,我们将提供Davis论文的概要,从血液学的开始到导致目前使用的设备的仪器改进。

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开拓者在血液学

历史上,Maxwell M. Wintrobe、Camille Dreyfus和M. L. Verso是三位重要的医生和历史学家,他们在血液学领域撰写了大量具有开创性的出版物。血细胞计数仪的历史与始于18世纪中期的血液学领域的兴起密切相关。以下三位先行者被温特布公认为“血液学之父”:威廉·休森、加布里埃尔·安德拉尔和乔治·海姆。休森(1739-1774)是一位来自英格兰的医生和实验生理学家。他是第一个证实血液中的红血球(红细胞)是单个粒子的人,这产生了血液粒子可以固定和枚举的想法。安德拉尔(1797-1876)是巴黎医学院的普通病理学教授。他能够通过化学分析测量血液中的水、固体、小球和纤维蛋白,这使他能够将疾病与这些元素的变化联系起来。Hayem(1841-1933)发明了最早用于血液计数的血球计。他还发现了血小板,对红细胞的形态变化进行了重要的观察,并记录了血液学疾病,如紫癜和贫血。该领域的另一位主要贡献者保罗·埃利希(Paul Ehrlich, 1854-1915)被称为“化疗之父”。 His work was crucial for the development of colorimetric dyes that allowed physicians to differentiate leukocytes such as granulocytes, lymphocytes, monocytes, eosinophils, and basophils. The hematological research by these pioneers greatly contributed to the development of hemacytometer [1].

血细胞仪的发展

许多最早记录的血液学实验起源于法国,在那里,临床医学和血液相关疾病引起了这些研究者的极大兴趣。Pierre Adolphe Piorry(1794-1879)首次尝试计数红细胞。他大力提倡将显微镜用于临床研究,重点是识别血液相关疾病。1847年,皮奥里提议将血样与硫酸钠溶液混合,并测量粘附在针尖上的一滴血的体积。这是第一次试图描述如何在“已知”体积的样本中分析血细胞。这项建议没有被当时的临床团体接受,因为医生不是经过培训的科学家,因此没有看到在临床医学中使用显微镜的实用性。早在1835年,加布里埃尔·安德拉尔(Gabriel Andral)就与人合著了一些最早的关于血液物理性质与疾病的文章[1]。他是最早通过特定生理参数(如小球、纤维蛋白、水和固体残留物)通过数值化学分析来表征和量化血液的人之一。1844年,阿尔弗雷德·多内(Alfred Donné,1801-1878)在促进使用显微镜以数字方式确定不同血液疾病之间的差异方面发挥了重要作用。与皮奥里一样,唐尼的想法在当时并未被法国医学界所接受。这里描述的三位法国科学家为血液研究和实验医学铺平了道路[1,2]。

到19世纪50年代中期,德国科学家通过数值分析将传统医学实践从感觉和印象(医生对患者问题的感觉)转变为实验室医学。因此,雇佣了大量全职研究科学家进行教学和实验,卡尔·维尔多特(Karl Vierdordt,1818-1884)发明了第一种精确的红细胞计数方法。Vierdordt是一名全科医生,后来成为Tübingen的副教授。1852年,他发表了一篇题为“定量mikroskopischen分析血液的Neue方法”或“血液定量显微镜分析的新方法”的论文,其中他描述了他精确的红细胞计数方法[1]。Vierdordt使用内径和长度分别为0.1-0.2 mm和5-8 mm的毛细管。将血液吸入试管后,他能够测量内径和长度,以准确确定试管内的血液体积。接下来,将血样从试管中排出,放在涂有蛋清的玻璃板上,让样本干燥。最后,检查玻璃板,并使用显微镜(将一个方形千分尺并入眼睛部分)对细胞进行计数。虽然这种方法既繁琐又耗时,至少需要三个小时来准备和计数,但它非常准确。

Vierdordt还发表了题为“Zählungen der Blutkörperchen des Menschen”或“人的血细胞计数”的第二篇文章,提出了使用他自己的血液的9个计数结果,平均~ 5,174,400个细胞/mm3或5.17 × 109个细胞/ml[1]。他的工作首次证明了对红细胞的准确评估[1,2]。

卡尔·维奥多特的设计之后进行了几项改进。赫尔曼·韦尔克(1822-1897)是维多特学院的学生,1854年对玻片作出了裁决。1855年,Antonj Cramer(1822-1855)通过在载玻片上粘贴平行带和在顶部粘贴薄玻璃载玻片,在计数室中形成0.011µl的体积,开发了一种计数室。他还在显微镜中加入了48个长方形规则,以便于手动计数,总面积为0.172 mm2。该方法可根据室内已知体积测定样品浓度。此外,毛细管作用使细胞分布更加均匀[1,2]。

图1。(右)路易·查尔斯·马拉塞兹设计的毛细管细胞计数器。(左)光学显微镜下毛细血管内血细胞的视野,带有目镜中的计数网格[1]。

图2。(右)由乔治·海姆设计和制造的计数室。(左)光学显微镜下圆形区域血细胞的视野,目镜中有计数网格[1]。

直到1874年,路易·查尔斯·马拉塞兹(1842-1909)描述了一种新的毛细管细胞计数方法,血细胞仪的发展才取得重大进展。当他是法国学院组织学实验室的副主任时,他开发了一个带有扁平毛细管的计数室,该毛细管粘在玻璃载玻片上,并给出了将毛细管长度与管内样本体积关联的规则(图1)。然后,可以通过计算试管中的红血球并乘以稀释系数来确定细胞浓度[1,2]。

Georges Hayem(1841-1933)于1875年开发了自己的血细胞仪室。Hayem将一块0.2毫米的玻璃板与一个直径为1厘米的孔粘合在一起,在那里可以精确测量厚度。该方法使用一滴血样直接涂在玻璃板的中心,并用盖玻片覆盖。由于毛细管作用未填充试验箱,因此样品均匀性是一个问题。然后,他使用一个带有固定长度x宽度(0.2 mm x 0.2 mm)的方形测微计的显微镜,并能够通过乘以测量高度约0.2 mm来确定细胞浓度(图2)。尽管Hayem的设备是为购买而制造和分发的,但由于其不一致性和繁琐的制备方法[1,2],在当时并不受欢迎。乐动ldsports

1877年,William Gowers(1845-1915)对Hayem的血细胞仪进行了改进,简化了计数方法。他是伦敦大学学院临床医学助理教授,1877年发表了一篇题为《关于血细胞计数》的文章[1]。在这篇文章中,Gowers描述说,其他国家只开发了少量的血细胞计数仪器,而德国或法国制造的仪器并不方便,因为显微镜必须根据目测规则进行专门修改和校准。为了简化计数方法的状态,Gowers与Hawksley先生合作开发了第一个计数室,直接在载玻片上进行计数,因此无需使用专门的显微镜。他的试验室被分成0.1 mm x 0.1 mm的正方形,高度为0.2 mm,可以确定准确的体积来测量细胞浓度(图3)。1906年晚些时候,他再次修改了商会的裁决,将其更改为0.1 mm x 0.2 mm的矩形,但由于当时《贸易杂志》上没有该产品[1,2],因此他的设备没有受到欢迎。

图3。由William Gowers设计和制造的计数室[1]。

下一个进步是由理查德·托马(1847-1923)于1881年提出的。他是海德堡大学病理研究所的助理教授,他与美国医生J.F.里昂发表了一篇论文。他的计数室是由一块直径11毫米的薄玻璃板和一块直径5毫米的玻璃板粘合而成,形成一个牛眼结构。外部玻璃板比内部玻璃板厚0.1 mm,因此在0.1 mm的高度形成一个自然腔室。在载玻片的中心底部,1 mm2面积的刻线分为16组25个正方形,因此每组正方形为0.25 mm x 0.25 mm。该腔室由卡尔蔡司光学公司和耶拿公司制造(图4)。霍克斯利随后对其进行了改进,他将该装置制成一个整体,而不是将多个部件粘合在一起。Thoma Zeiss血细胞计数器的设计被指定为“1912最广泛使用和最满意的计数小工具”,James Campbell Todd是科罗拉多大学医学院临床病理学教授,1, 2。

图4。(左)由理查德·托马和卡尔·蔡司设计和制造的计数室。(中间)蚀刻在玻璃室表面的计数网格。(右)网格中红细胞的放大图像[1]。

与此同时,Louis Charles Malassez开发了第二种血球计,名为chamber humide graduée。该装置是通过在样品平台周围设置1毫米深的沟渠来制作的。将血液样本用条形固定在圆形表面,用4颗螺钉将盖玻片固定在固定位置。通过样品平台与周围表面的差值来计算液体的厚度。然后,将水引入沟渠,防止样品蒸发,然后正常计数细胞[1,2]。

1884年,在巴黎工作的俄罗斯科学家谢尔盖·阿尔弗罗(Sergei Alferow)认为,由于设备不好,而且最重要的是,计数室内的细胞分布不均匀,很难获得准确的血细胞计数。因此,他开发了自己的血细胞仪和方法。他的装置包括通过两个平行槽将计数平台与滑道隔离。深度通过四个测微计螺钉或已知高度的玻璃管进行调整,玻璃盖卡瓦将专门设计用于安装。盖玻片用两个夹子固定,腔室通过毛细管作用填充(类似于1855年Antonj Cramer的),以改善腔室中细胞分布的均匀性(图5)。阿尔弗罗是第一个拍摄显微照片的人,他将图像投射到一个有规则的玻璃圆盘上,然后用铅笔对每个细胞进行计数和标记。他认为他的方法更准确,因为显微照片是计数室中细胞的精确记录[1,2]。

图5。由Sergei Alferow设计和制造的计数室[1]。

图6。W.Brünings设计和制造的移液和计数装置[1]。

1903,Zu富有大学的病理研究所的W. Br -尤因斯发明了一种新型的血细胞计数器,它能在芯片上混合样品。该装置通过移液管和抽吸机构连接到二级混合室。在移液管中混合血样后,血样将直接转移到计数场(图6),从而使他的血细胞仪成为首批“芯片实验室”设备之一[1,2]。

卡尔·比克尔(1872-1957)在简化计数过程和提高准确性方面进行了最重大的创新。他通过1905年至1913年间发表的一系列文章描述了他的血细胞仪的发展[1]。Bürker血细胞仪由一个沉重的载玻片和三个表面胶结的玻璃平台制成。三个玻璃平台平行布置在重型玻璃上,中间平台(25 mm x 5 mm的地板件)被一条1.5 mm的沟渠分为两部分,两侧为圆形端。两个外部玻璃平台(21 mm x 7.5 mm)比地板高0.1 mm,由1.5 mm宽的通道隔开。当将玻璃盖卡瓦夹在两个外部平台上时,形成0.1 mm的深度。在地板上,做出了两项单独的裁决,两个分区的两侧各有一项裁决。裁决为1 mm2,也分为400个小正方形(图7)。除了能够利用毛细血管作用填充细胞外,血细胞仪还有两个侧面(重复计数室)可以重复计数,而无需重新清洁细胞室。经过不断的改进,到1921年,该设备被认为是最好的细胞计数室,并已超过托马斯蔡司血细胞仪,成为最常用的仪器[1,2]。

图7。由Karl Bürker设计和制造的计数室[1]。

计数网格的改进

图8。(a) 由J.Zappert设计的计数网格通过添加外线形成9 mm2的面积。(b) A.Elzholz添加了3对垂直线。(c) W.Türk增加了3对水平线。(d) O.Neubauer[1]将双线改为单线以及水平线和垂直线的组合。

血细胞仪的规则和计数网格在其演变过程中发生了多次变化。THOMA在1879中设计的计数网格是早期血细胞计数器的基础,但随着血液学领域的发展,研究人员认识到计数网格不适合白细胞测量,因为它们主要用于计数较小的红细胞和血小板。

1892年,J.Zappert添加了外线以形成9 mm2的面积,其中形成了9个1 mm2的独立正方形(图8a)。1894年,A.Elzholz在左栏和右栏中添加了三对垂直线(图8b)。1902年,W.Türk在Elzholz的设计中增加了三对水平线,从而使计数网格与目前的网格相似(图8c)。该设计取代了最初的托马十字网格,直到1907年,O.Neubauer将线条改为单线而非双线,以简化网格布局(图8d),从而提高了设计的清晰度,并在1922年成为最常用的计数网格[1]。

总结

图9。(左)现代血细胞仪,具有类似于Bürker室的双室和(右)Neubauer计数网格[3]

一个多世纪以来,血细胞仪从血液学领域刚刚起步时的简单起步,逐渐发展到今天全世界使用的精密制造仪器(图9)。尽管血细胞仪的型号和技术仍然各不相同,但血细胞仪仍然是实验室和临床上细胞计数的金标准。在下一节中,我们将讨论血细胞计误差的固有来源以及可以采取的基本步骤,以最大限度地减少这些误差,从而提高细胞计数和后续检测的准确性体外实验。

工具书类

  1. Davis, j.d.,《血细胞计数仪及其对进步时代医学的影响》,刊于1995年伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校历史系。p。268。
  2. Verso,M.L.,一些十九世纪血液学的先驱。医学史,1971年。15(1):p。55-67.
  3. Rouge,M.用血细胞仪计数细胞。2002; 可从以下网址获得:http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/hemacytometer.html.