凋亡事件的检测

介绍了细胞凋亡

细胞凋亡,即程序性细胞死亡,是维持组织稳态和调节生理功能所必需的正常过程。细胞凋亡的激活途径主要有两种:外在途径和内在途径。外部途径由配体(包括TNFα, FasL和TRAIL)与细胞表面受体的结合激活。当有毒药物或紫外线照射导致DNA或细胞损伤时,固有的或线粒体途径通常会被激活。在蛋白水解caspase-3时,内源性和外源性途径的汇合发生。

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目前,Cellometer Vision CBA系统可以通过检测Caspase 3和8、JC-1和膜联蛋白V来测量细胞凋亡。

外部和内部凋亡途径

改编自《胆道上皮病理生理学》ISBN: 1-58706-171-6

膜联蛋白V和坏死的检测

膜联蛋白V概述

另一种凋亡检测方法可以通过膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)检测来实现。膜联蛋白V是细胞内蛋白膜联蛋白家族的成员,以钙依赖性方式与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。在健康细胞中,PS通常只存在于质膜的细胞内小叶上,但在细胞凋亡过程中,PS易位到细胞外小叶。荧光标记的膜联蛋白V可用于特异性靶向和识别凋亡细胞表面的PS。膜联蛋白V单独结合不能区分凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。碘化丙啶溶液是一种膜排斥染料,进入细胞膜受损的细胞并与其DNA结合。具有完整细胞膜的早期凋亡和健康细胞将排除PI,而具有受损细胞膜的晚期凋亡和坏死细胞用PI染色。Annexin V-FITC和PI的使用使研究人员能够基于%正常、%凋亡和%坏死/晚期凋亡细胞来描述细胞群。

积极的控制通常是必要的,以优化实验方案和获得仪器基线。在Cellometer的例子中,阳性对照是用10µM α-TOS(一种诱导凋亡的药理学试剂)过夜处理Jurkat细胞产生的。阴性对照样品未使用α-TOS处理。

亮场和荧光细胞图像

如上图所示,三张显微照片:凋亡阳性样本的亮场、膜联蛋白V(绿色)和PI(红色)。从这些捕获的玻璃纤维计图像中获得的荧光强度数据导出到FCS Express软件。

荧光强度数据图

数据显示为散点图,每个象限代表一个特定的细胞群。左下象限显示膜联蛋白V和PI阴性的活细胞。左上象限显示仅为PI阳性的死细胞/碎片细胞。右下象限显示膜联蛋白V阳性的凋亡细胞。右上象限显示的坏死细胞膜联蛋白V和PI均呈阳性。

细胞群和浓度数据表

此表显示了活细胞、凋亡细胞、坏死细胞和碎片细胞群。

JC-1活性检测

JC-1概述

另一种检测细胞凋亡的方法是检测JC-1,一种线粒体膜电位染料。在健康细胞中,JC-1通过细胞膜扩散到细胞质中,发出绿色荧光。由于JC-1的阳离子性质,它迁移到线粒体中,净负电荷为- 180mv。随着线粒体内JC-1浓度的增加,JC-1开始形成荧光红色的聚集物。然而,在细胞凋亡或用药物(如CCCP)处理的细胞中,线粒体膜电位的丧失阻止JC-1在线粒体内形成聚集物,因此JC-1在细胞质中发出绿色荧光。线粒体膜的通透性导致细胞色素c的释放,caspase 9和caspase 3的活化。

收集培养的Jurkat细胞,在37°C下不(对照)或与羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)一起孵育,以破坏线粒体膜电位5分钟

在与CCCP孵育后,用JC-1试剂盒(LifeTechnologies)对细胞进行染色:将200µM的10μl JC-1添加到1mL Jurkat细胞(~2×10^6)中,每个样品并在孵育器中孵育30分钟。(染色后的清洗是可选的,在本实验中未进行。)

JC-1作为膜电位染料的作用模式

改编自普渡细胞检测光盘系列,第3卷

控制细胞Jurkat

未经处理的Jurkat细胞用JC-1染色,Cellometer Vision CBA成像,数据导出到FCS Express软件。健康细胞主要表现为水户红在线粒体内的聚集,如亮红色染色所示,水户红在10^4处有一个强强度峰值。

明亮的视野,水户绿色和水户红色健康Jurkat细胞的图像

平均强度数据图:对照Jurkat细胞

CCCP处理的Jurkat细胞

Jurkat细胞经CCCP(羰基氰化物-氯苯酰腙)处理后,用JC-1染色,Cellometer Vision CBA成像,数据输出到FCS express。线粒体膜电位的损失导致水藤红的急剧下降,在荧光图像和生成的直方图中都可以看到。

处理过的Jurkat细胞的明亮视野,水户绿和水户红图像

平均强度数据图:处理过的Jurkat细胞

在健康的Jurkat细胞中,JC-1在线粒体中形成聚集物,导致强烈的红色荧光信号。在线粒体电位被破坏的细胞中,JC-1不形成聚集物,因此观察到的红色荧光非常少。

Cellometer采集每个样本的多个图像,并将细胞荧光强度导出到FCS Express中进行分析。将数据绘制为绿色和红色荧光强度的直方图。红/绿平均荧光强度的降低(对照组从552.29降低到治疗组的39.18)表明线粒体去极化。

Caspase 3/8活性检测

半胱天冬酶3/8概述

在非凋亡细胞中,蛋白酶原8和蛋白酶原3是不活跃的半胱氨酸蛋白酶。在激活凋亡后,发生一个信号级联反应,其中前蛋白酶-8被切割为活性的半胱天冬酶-8蛋白酶。半胱天冬酶-8快速将原半胱天冬酶-3转化为活性半胱天冬酶-3。一旦半胱天冬酶-3被激活,一系列不可逆事件就会启动,导致细胞死亡,包括激活CAD(半胱天冬酶激活的DNA酶)内切酶,该内切酶降解细胞核内的DNA并启动染色质凝聚。

CaspGLOW™Fluorescein Active Caspase-3或Caspase 8染色试剂盒提供了一种简单、灵敏的检测活细胞中活性Caspase-3/8的方法。在检测Caspase -3时,我们使用了一种特定的fitc偶联的Caspase -3抑制剂DEVD-FMK(或Caspase 8的IETD-FMK)。这两种抑制剂,DEVD-FMK和IETD-FMK都是细胞可渗透的,并且不可逆地结合到凋亡细胞中活性的Caspase -3或Caspase - 8。抑制剂上的荧光标记(FITC)可用于检测细胞凋亡。

细胞荧光强度数据被绘制成每个样本的直方图。相关数据表显示了caspase(+)的细胞百分比和caspase(-)的细胞总数百分比。

半胱天冬酶3积极

对处理后的Jurkat细胞进行成像,并将数据导出到FCS Express软件中。caspase信号的平均强度被绘制成直方图,以确定处理过的Jurkat种群中阳性和阴性的百分比。

经处理的Jurkat细胞的亮场和半胱天冬酶图像

Caspase阳性活性数据图

细胞群 %的细胞 浓度(x10^6个细胞/毫升)
总计 100.00 2.80
半胱天冬酶+ 57.44 1.61
半胱天冬酶- 42.36 1.18

半胱天冬酶3阴性

对照Jurkat细胞成像,数据导出到FCS Express软件。caspase信号的平均强度绘制成直方图,以确定对照Jurkat种群的阳性百分比和阴性百分比。

对照Jurkat细胞的亮场和半胱天冬酶图像

半胱天冬酶阴性活性数据图

细胞群 %的细胞 浓度(x10^6个细胞/毫升)
总计 100.00 4.52
半胱天冬酶+ 30.04 1.36
半胱天冬酶- 69.84 3.15

细胞凋亡检测

4个简单步骤检测细胞凋亡

使用Cellometer K2或Vision CBA,仅向Cellometer计数室添加20µl样品。样品的成像和分析在30秒内完成。可以查看亮场和荧光细胞图像,以检查细胞形态和验证细胞计数。细胞总数、浓度和平均直径将自动显示。

1.将20µl的样品移液到一次性载玻片中。

2.将幻灯片插入仪器

3.从下拉菜单中选择分析

4.单击计数,获取图像并查看细胞计数、浓度、直径

结论

细胞仪图像细胞检测是一种强大的系统,可以通过多种方法检测细胞凋亡。通过检测Caspase 8、Caspase 3和JC-1可以检测早期凋亡事件。凋亡级联激活的下游结果是磷脂酰丝氨酸转移到细胞膜的外叶,膜联蛋白v可以检测到磷脂酰丝氨酸。最后,碘化丙啶可以检测到通过凋亡进入坏死的细胞。

使用Cellometer检测细胞凋亡的出版物

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  • Verma M, Shulga N, Pastorino JG。(2013) Sirtuin-3调节Bak/Bax依赖性凋亡。细胞科学杂志126(1):274-88
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  • Chan LL,Lai N,Wang EA,et al.(2011)细胞凋亡和坏死的快速检测方法,使用细胞仪成像细胞仪测量。细胞凋亡16 (12): 1295 - 303