凋亡事件的检测
介绍了细胞凋亡
细胞凋亡，即程序性细胞死亡，是维持组织稳态和调节生理功能所必需的正常过程。细胞凋亡的激活途径主要有两种:外在途径和内在途径。外部途径由配体(包括TNFα， FasL和TRAIL)与细胞表面受体的结合激活。当有毒药物或紫外线照射导致DNA或细胞损伤时，固有的或线粒体途径通常会被激活。在蛋白水解caspase-3时，内源性和外源性途径的汇合发生。
目前，Cellometer Vision CBA系统可以通过检测Caspase 3和8、JC-1和膜联蛋白V来测量细胞凋亡。
外部和内部凋亡途径
改编自《胆道上皮病理生理学》ISBN: 1-58706-171-6
膜联蛋白V和坏死的检测
膜联蛋白V概述
另一种凋亡检测方法可以通过膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）检测来实现。膜联蛋白V是细胞内蛋白膜联蛋白家族的成员，以钙依赖性方式与磷脂酰丝氨酸（PS）结合。在健康细胞中，PS通常只存在于质膜的细胞内小叶上，但在细胞凋亡过程中，PS易位到细胞外小叶。荧光标记的膜联蛋白V可用于特异性靶向和识别凋亡细胞表面的PS。膜联蛋白V单独结合不能区分凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。碘化丙啶溶液是一种膜排斥染料，进入细胞膜受损的细胞并与其DNA结合。具有完整细胞膜的早期凋亡和健康细胞将排除PI，而具有受损细胞膜的晚期凋亡和坏死细胞用PI染色。Annexin V-FITC和PI的使用使研究人员能够基于%正常、%凋亡和%坏死/晚期凋亡细胞来描述细胞群。
积极的控制通常是必要的，以优化实验方案和获得仪器基线。在Cellometer的例子中，阳性对照是用10µM α-TOS(一种诱导凋亡的药理学试剂)过夜处理Jurkat细胞产生的。阴性对照样品未使用α-TOS处理。
亮场和荧光细胞图像
如上图所示，三张显微照片：凋亡阳性样本的亮场、膜联蛋白V（绿色）和PI（红色）。从这些捕获的玻璃纤维计图像中获得的荧光强度数据导出到FCS Express软件。
荧光强度数据图
数据显示为散点图，每个象限代表一个特定的细胞群。左下象限显示膜联蛋白V和PI阴性的活细胞。左上象限显示仅为PI阳性的死细胞/碎片细胞。右下象限显示膜联蛋白V阳性的凋亡细胞。右上象限显示的坏死细胞膜联蛋白V和PI均呈阳性。
细胞群和浓度数据表
此表显示了活细胞、凋亡细胞、坏死细胞和碎片细胞群。
JC-1活性检测
JC-1概述
另一种检测细胞凋亡的方法是检测JC-1，一种线粒体膜电位染料。在健康细胞中，JC-1通过细胞膜扩散到细胞质中，发出绿色荧光。由于JC-1的阳离子性质，它迁移到线粒体中，净负电荷为- 180mv。随着线粒体内JC-1浓度的增加，JC-1开始形成荧光红色的聚集物。然而，在细胞凋亡或用药物(如CCCP)处理的细胞中，线粒体膜电位的丧失阻止JC-1在线粒体内形成聚集物，因此JC-1在细胞质中发出绿色荧光。线粒体膜的通透性导致细胞色素c的释放，caspase 9和caspase 3的活化。
收集培养的Jurkat细胞，在37°C下不(对照)或与羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)一起孵育，以破坏线粒体膜电位5分钟
在与CCCP孵育后，用JC-1试剂盒（LifeTechnologies）对细胞进行染色：将200µM的10μl JC-1添加到1mL Jurkat细胞（~2×10^6）中，每个样品并在孵育器中孵育30分钟。（染色后的清洗是可选的，在本实验中未进行。）
JC-1作为膜电位染料的作用模式
改编自普渡细胞检测光盘系列，第3卷
控制细胞Jurkat
未经处理的Jurkat细胞用JC-1染色，Cellometer Vision CBA成像，数据导出到FCS Express软件。健康细胞主要表现为水户红在线粒体内的聚集，如亮红色染色所示，水户红在10^4处有一个强强度峰值。
明亮的视野，水户绿色和水户红色健康Jurkat细胞的图像
平均强度数据图：对照Jurkat细胞
CCCP处理的Jurkat细胞
Jurkat细胞经CCCP(羰基氰化物-氯苯酰腙)处理后，用JC-1染色，Cellometer Vision CBA成像，数据输出到FCS express。线粒体膜电位的损失导致水藤红的急剧下降，在荧光图像和生成的直方图中都可以看到。
处理过的Jurkat细胞的明亮视野，水户绿和水户红图像
平均强度数据图:处理过的Jurkat细胞
在健康的Jurkat细胞中，JC-1在线粒体中形成聚集物，导致强烈的红色荧光信号。在线粒体电位被破坏的细胞中，JC-1不形成聚集物，因此观察到的红色荧光非常少。
Cellometer采集每个样本的多个图像，并将细胞荧光强度导出到FCS Express中进行分析。将数据绘制为绿色和红色荧光强度的直方图。红/绿平均荧光强度的降低（对照组从552.29降低到治疗组的39.18）表明线粒体去极化。
Caspase 3/8活性检测
半胱天冬酶3/8概述
在非凋亡细胞中，蛋白酶原8和蛋白酶原3是不活跃的半胱氨酸蛋白酶。在激活凋亡后，发生一个信号级联反应，其中前蛋白酶-8被切割为活性的半胱天冬酶-8蛋白酶。半胱天冬酶-8快速将原半胱天冬酶-3转化为活性半胱天冬酶-3。一旦半胱天冬酶-3被激活，一系列不可逆事件就会启动，导致细胞死亡，包括激活CAD（半胱天冬酶激活的DNA酶）内切酶，该内切酶降解细胞核内的DNA并启动染色质凝聚。
CaspGLOW™Fluorescein Active Caspase-3或Caspase 8染色试剂盒提供了一种简单、灵敏的检测活细胞中活性Caspase-3/8的方法。在检测Caspase -3时，我们使用了一种特定的fitc偶联的Caspase -3抑制剂DEVD-FMK(或Caspase 8的IETD-FMK)。这两种抑制剂，DEVD-FMK和IETD-FMK都是细胞可渗透的，并且不可逆地结合到凋亡细胞中活性的Caspase -3或Caspase - 8。抑制剂上的荧光标记(FITC)可用于检测细胞凋亡。
细胞荧光强度数据被绘制成每个样本的直方图。相关数据表显示了caspase(+)的细胞百分比和caspase(-)的细胞总数百分比。
半胱天冬酶3积极
对处理后的Jurkat细胞进行成像，并将数据导出到FCS Express软件中。caspase信号的平均强度被绘制成直方图，以确定处理过的Jurkat种群中阳性和阴性的百分比。
经处理的Jurkat细胞的亮场和半胱天冬酶图像
Caspase阳性活性数据图
| 细胞群 | %的细胞 | 浓度（x10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 总计 | 100.00 | 2.80 |
| 半胱天冬酶+ | 57.44 | 1.61 |
| 半胱天冬酶- | 42.36 | 1.18 |
半胱天冬酶3阴性
对照Jurkat细胞成像，数据导出到FCS Express软件。caspase信号的平均强度绘制成直方图，以确定对照Jurkat种群的阳性百分比和阴性百分比。
对照Jurkat细胞的亮场和半胱天冬酶图像
半胱天冬酶阴性活性数据图
| 细胞群 | %的细胞 | 浓度（x10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 总计 | 100.00 | 4.52 |
| 半胱天冬酶+ | 30.04 | 1.36 |
| 半胱天冬酶- | 69.84 | 3．15 |
细胞凋亡检测
4个简单步骤检测细胞凋亡
使用Cellometer K2或Vision CBA，仅向Cellometer计数室添加20µl样品。样品的成像和分析在30秒内完成。可以查看亮场和荧光细胞图像，以检查细胞形态和验证细胞计数。细胞总数、浓度和平均直径将自动显示。
1.将20µl的样品移液到一次性载玻片中。
2.将幻灯片插入仪器
3.从下拉菜单中选择分析
4.单击计数，获取图像并查看细胞计数、浓度、直径
结论
细胞仪图像细胞检测是一种强大的系统，可以通过多种方法检测细胞凋亡。通过检测Caspase 8、Caspase 3和JC-1可以检测早期凋亡事件。凋亡级联激活的下游结果是磷脂酰丝氨酸转移到细胞膜的外叶，膜联蛋白v可以检测到磷脂酰丝氨酸。最后，碘化丙啶可以检测到通过凋亡进入坏死的细胞。
使用Cellometer检测细胞凋亡的出版物
- Berger EA, McClellan SA, Vistisen KS, Hazlett LD. (2013) HIF-1α对铜绿假单胞菌角膜炎中PMN的有效杀灭、抗菌肽的产生和细胞凋亡至关重要。PLoS病原体9(7)
- Verma M, Shulga N, Pastorino JG。(2013) Sirtuin-3调节Bak/Bax依赖性凋亡。细胞科学杂志126(1):274-88
- Yedjou CG, Saeed MA, Alamgir Hossain M, et al.(2012)人工合成azammacrocycle诱导人肝癌(HepG(2))细胞基本凋亡和坏死细胞死亡。环境毒理学28日(8)9
- Chan LL，Lai N，Wang EA，et al.（2011）细胞凋亡和坏死的快速检测方法，使用细胞仪成像细胞仪测量。细胞凋亡16 (12): 1295 - 303