图像细胞术检测活细胞自噬活性的方法

介绍了自噬

自噬是一个重要的细胞分解代谢过程,扮演着多种重要的角色,包括饥饿期间氨基酸库的维持,受损蛋白质和细胞器的循环,以及细胞内微生物的清除。首先,被称为自噬体的双层膜泡将受损的蛋白质、细胞器或外来微生物分离出来。然后囊泡完成受损细胞器的包裹,然后与溶酶体融合。自吞噬泡。最后,这些物质在自溶酶体内被降解,营养物质被回收回细胞。目前采用的自噬检测方法有荧光显微镜、生化检测和Western blotting,但这些方法耗时、费力,需要大量经验才能准确解释。

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通过利用图像细胞术,可以通过荧光分析检测和测量荧光标记的自噬体。Cellometer视觉已经用于证明的检测和使用专有污渍荧光标记的自噬体的总荧光强度的测定(CYTO-ID®绿从恩佐生命科学染料)和在活细胞中GFP-LC3蛋白。

图像细胞检测法已被证明可以产生与流式细胞术相当的荧光强度数据,这可以作为一种显示活细胞自噬活性水平的替代方法。这可以作为一种有用的方法来快速评估不同化学或生物试剂处理活细胞时的自噬反应,以及一种可用于支持与各种病理疾病相关的基于自噬的药物发现的替代技术。

目前的自噬检测方法

目前,大多数检测方法依赖于检测自噬体上表达的LC3-II蛋白。下面是目前检测LC3-II自噬水平的方法对比表。

自噬的检测方法 方法描述 方法的缺点
免疫印迹 传统蛋白分析方法定量靶细胞样品中LC3-II蛋白的含量。与对照组比较的蛋白带将决定是否存在自噬活性。
  • 耗时且繁琐的过程。端点检测
  • 结果完全基于蛋白质的数量。没有细胞图像
荧光显微镜 一种定性观察GFP标记的自噬体或旁斑的成像方法。当细胞是自噬的时,形成更多的自噬体,因此出现更多的GFP-PUNCTA。
  • 定性观察而不是定量分析
  • 没有自动化,吞吐量低
扫描电子显微镜 一种高分辨率成像方法,在高倍镜下定性观察细胞内的自噬体颗粒。
  • 非常昂贵,需要经验丰富的运营商
  • 低通过,没有人口分析
流量/图像细胞术 使用CytoID®Green染料特异性染色细胞中的酸性颗粒,如自噬体。
  • 相对昂贵,维护费用高
  • 需要有经验的使用者正确操作
  • 无法视觉观察自噬体

视觉图像细胞检测

Cellometer视觉操作

  • 将靶细胞样品移液到一次性计数室中
  • 腔体被插入到测压仪视觉中
  • 荧光和亮场图像在4个位置被捕获
  • 动态浓度范围为105- 107细胞/毫升
  • 图像分析数据导出到FCS Express进行荧光分析
  • 图像采集和分析过程不超过2分钟,这可能与荧光曝光时间有关

1.用移液管将20µL的样品移入一次性计数室

2.将计数室插入测压仪视野

3.图像采集与分析

  • 明亮的视野和荧光图像被捕获用于图像分析
  • 细胞自动计数在明亮的领域
  • 从每个计数的细胞中测量荧光强度
  • 从自噬细胞群中测量平均荧光强度

用GFP标记的LC3蛋白测定细胞自噬活性

  • 标准的GFP标记在LC3蛋白上表达,LC3蛋白是自噬体的特异性生物标志物
  • 将PA-TU-8988T细胞在雷帕霉素药物作用24小时后培养,诱导细胞自噬活性
  • 用视觉图像细胞仪捕捉并鉴定荧光阳性GFP-LC3细胞

gfp标记的LC3在PA-TU-8988T细胞中的成像

使用Cyto-ID绿色染料测定自噬活性水平

细胞ID绿色染料染色方案

  • Cyto-ID Green染料(8µl)与4ml 1X缓冲液混合
  • 离心细胞样品并重新悬浮到200μl制备的CyTO-ID绿色染料中
  • 细胞标本37°C孵育30分钟后进行图像或流式细胞仪分析

细胞识别染色PC3细胞

斑点是细胞id绿色染色自噬体,出现在细胞自噬

自噬活性的因素

用自噬活性因子(AAF)测量细胞群内的自噬活性水平

MFI =平均荧光强度

一种)HeLa细胞饥饿后,用Cyto-ID Green染色,显示自噬体数量增加

b)细胞自噬诱导的HeLa细胞用Cyto-ID Green染色,转染RFP-LC3 -共定位

图像与流式细胞术的比较

  • Jurkat细胞在Hank 's Balance Saline Solution (HBSS)中饥饿2小时,在培养基中恢复1小时
  • Cellometer和FACS Calibur的荧光信号分别显示饥饿和恢复的高、低信号
  • 通过将饥饿Jurkat细胞与对照组比较,计算AAF值
  • 在Cellometer和FACS Calibur之间AAF值的变化趋势具有可比性

化学诱导Jurkat细胞自噬活性的检测

雷帕霉素时间依赖性剂量反应

  • 用雷帕霉素治疗Jurkat细胞,诱导4,8和18小时的自噬诱导化学品
  • 不同浓度雷帕霉素(0.01,0.1,1,10,100µM)的剂量响应
  • 结果显示,随着培养时间的增加,不同浓度的雷帕霉素的AAF值增加
  • 与4、8 h相比,18 h时的AAF值最高。

自噬活性因子在Jurkat细胞中的增加是时间和药物依赖的

胰蛋白酶化贴壁PC3细胞的自噬检测

  • 贴壁细胞是自噬研究领域的常用研究对象,因此我们以PC3前列腺癌细胞为研究对象,利用Cellometer图像流式细胞术检测贴壁细胞株的自噬活性
  • 用不同浓度的雷帕霉素处理PC3细胞,随着浓度的增加,荧光图像中出现更多的斑点
  • 相应的,平均荧光强度较高的细胞群如上表所示
  • 随着雷帕霉素浓度增加,计算的AAF值也增加了增加

在PC3细胞中,100um药物处理后细胞自噬活性最高

(雷帕霉素) 控制 1µM 10µM 100µM
平均FL强度(R.U.) 3543.53 4093.25 5536.15. 6042.04
空军联队的价值观 0.00 13.43 35.99 41.35

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