用于细胞周期分析的图像细胞仪
细胞周期概论
什么是细胞周期？
细胞周期被定义为“细胞连续分裂之间的周期”。真核细胞的标准细胞周期分为4个阶段。
细胞周期期
- G1.（G=间隙）阶段。细胞正在为DNA复制做准备。在这个阶段，细胞含有大约相同数量的DNA。细胞的二倍体数是细胞中染色体的数量。这个数字通常缩写为2n，其中n代表染色体的数量。因为人类细胞中通常有23对染色体：2n=46
- S（S=合成）相. 核DNA的复制发生在这个阶段。在S期，G和G之间存在广泛的DNA含量分布1.和G2.阶段到这个阶段结束时，DNA含量增加了一倍。（2n到4n）
- G2.（G=间隙）阶段。DNA复制完成，细胞正在生长并准备分裂。在这个阶段，细胞包含的染色体数量（4n）是G1..
- M（M=有丝分裂）期. 细胞分裂。在细胞分裂结束时，每个细胞现在包含相同数量的DNA:2n
细胞周期研究的重要性
肿瘤科
由于癌细胞经常经历异常的细胞分裂和增殖，了解它们的细胞周期很重要。
药物学
涉及药理试剂特性及其对细胞周期调节作用的研究。
在化疗期间阻止正常的细胞周期。
细胞/分子生物学
为了理解细胞、分子和生物学机制，必须检查它们在细胞周期中的作用。
当前的检测方法
放射性测量
3.胸腺嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷的放射性标记。在DNA复制时，放射性标记的胸苷被并入新的DNA中。
基于荧光的检测
活细胞测量
赫氏33342–具有细胞渗透性，因此不需要细胞固定。与双链DNA的小凹槽结合。
固定单元测量
溴脱氧尿苷（BrdU）–胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞周期的S期并入基因组。使用抗BrdU抗体检测。
大皮–结合到DNA的AT丰富区域。活细胞渗透性差，因此经常使用后固定。
碘化丙啶（PI）–一种膜排斥染料和插层剂，可在细胞固定时染色细胞基因组。
基于荧光的，使用玻璃纤维计的固定细胞测量
用碘化丙啶（PI）标记DNA可以进行基于荧光的细胞周期分析。
该分析生成关于PI荧光强度的细胞群直方图（右侧）。
PI荧光强度的数量与每个细胞内的DNA数量相关。
因为DNA的数量增加了一倍（2n→ 4n）在G之间1.和G2.细胞群的荧光强度也从2000个荧光单位增加到4000个荧光单位。
细胞周期在5个简单的步骤
1.用移液管将20µl样品移入一次性载玻片中。
2.将滑轨插入光纤表仪器
3.从下拉菜单中选择分析
4.单击计数，获取图像并查看细胞计数、浓度和直径
5.使用Vision CBA导出数据以获得细胞周期直方图结果
细胞系的细胞周期检测示例
PC3
| 细胞群 | %门控细胞 | 浓度 （10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 全部的 | 100 | 4.8 |
| 子G1. | 0.1 | 0 |
| G0/G1. | 80 | 3.9 |
| s | 2.8 | 0.1 |
| G2./M | 16.2 | 0.8 |
PANC-1
| 细胞群 | %门控细胞 | 浓度 （10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 全部的 | 100 | 5.7 |
| 子G1. | 1.2 | 0.1 |
| G0/G1. | 59.3 | 3.4 |
| s | 20.5 | 1.2 |
| G2./M | 18.4 | 1.1 |
希拉
| 细胞群 | %门控细胞 | 浓度 （10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 全部的 | 100 | 3.7 |
| 子G1. | 2.2 | 0.1 |
| G0/G1. | 66.8 | 2.5 |
| s | 14.2 | 0.5 |
| G2./M | 14.6 | 0.5 |
尤尔卡特
| 细胞群 | %门控细胞 | 浓度 （10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 全部的 | 100 | 5.2 |
| 子G1. | 4 | 0.2 |
| G0/G1. | 62.3 | 3.3 |
| s | 16.4 | 0.9 |
| G2./M | 16.1 | 0.8 |
细胞周期实验
PI染色固定细胞样本的方案
-
- 使用Cellometer样本调整计算器确定获得200万个细胞起始数量所需的样本量。
- 在200–400 x g下旋转细胞样品5分钟，然后将细胞颗粒重新悬浮在200µl PBS中*（最终浓度为5 x 106.到1 x 107.细胞/毫升）
*如果使用甲醇，不要在200µl PBS中重新悬浮细胞颗粒。在500µl 100%冰冷甲醇中重新悬浮细胞颗粒，并在冰上保持15分钟。
-
- 逐渐添加500µl 200-proof（100%）冰凉乙醇以固定细胞。用移液管轻轻搅拌至少十次，然后在冰上保持15分钟。（固定电池可在-70°C下冷冻，以便稍后进行分析。）
- 以200–400 x g（~1000到2000 rpm）旋转细胞样品8分钟，去除PBS/乙醇或甲醇溶液，将颗粒重新悬浮在150µl PI染色溶液中。通过移液管轻轻混合，直到样品中没有可见的细胞团（超过十次）。
- 在37°C培养箱中培养染色样品40分钟。
- 将电池旋转200–400 x g（~1000–2000 rpm），持续8分钟。在不干扰颗粒的情况下，小心地去除染色溶液。然后将细胞重新悬浮在200µl PBS中。
- 在30分钟内分析染色细胞。在分析前，将其储存在黑暗中。
- 将20µL装载到纤维计计数室中，并将滑块插入仪器中。
实验数据
Jurkat细胞用于分析细胞周期阻滞药物诺可达唑和依托泊苷治疗后的细胞周期动力学。Jurkat细胞仅与培养基（对照）、诺可达唑（0.004、0.02、0.1µg/mL）或依托泊苷（0.06µM、0.12µM）孵育24小时。将对照细胞和药物处理细胞固定，然后用碘化丙啶染色。对于每个样品，20µl细胞样品（约4 x 106.细胞/mL）被加载到纤维计成像室中，插入视觉CBA分析系统，并在亮场和荧光中成像。测量每个细胞的荧光强度。
亮场图像
玻璃纤维计仪器为每个测试样品获取一个亮场图像。亮场图像允许研究人员验证细胞形态，评估样本的均匀程度，并确定细胞碎片的存在。
荧光图像
因为所有的细胞都已固定，所以所有的细胞都用碘化丙啶染色并出现在荧光图像中。
荧光计数图像
荧光计数图像可用于确认细胞计数正确。单个计数的细胞以绿色显示。未计数的单元格以黄色显示。Cellometer软件使用专有算法精确计算集群中的单个细胞
细胞周期直方图
使用FCS Express Flow软件中优化的Nexcelom单元周期数据布局，为每个样本自动生成单元周期直方图。可以直接在直方图上手动优化选通，并自动更新相关数据表。对照样品和实验样品的直方图和数据表见下面的实验数据部分。
细胞周期分析
对于对照样品（图1，表1），超过一半的细胞群位于G0/G1.在S期（超过20%）和G期也有不同的细胞群2./M期（15%以上），亚G期1.以下直方图中的组包括细胞碎片和晚期凋亡和坏死细胞。为对照样品设置选通，并应用于所述两个实验条件下的直方图。
图1。控制
使用FCS Express软件生成的控制样本的总体直方图。Sub-G1.人口以红色表示，G0/G1.相位布居为蓝色，S相位布居为棕色，G相位布居为蓝色2./M期人口呈绿色。
表1
| 细胞群 | %总细胞数 | 浓度 （x 10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 全部的 | 100 | 11.7 |
| Sub-G1. | 2.1 | 0.2 |
| G0/G1. | 54 | 6.3 |
| s | 26.4 | 3.1 |
| G2./M | 15.4 | 1.8 |
以剂量依赖性的方式添加细胞周期阻滞药物依托泊苷，导致细胞群从G0/G1.G阶段2./M期。（图2和图3）。
图2。0.06µM依托泊苷
使用FCS Express软件生成的0.06µM依托泊苷样本的总体直方图。在G细胞中滞留的细胞百分比显著增加2./M阶段（见表2）。Sub-G1.人口以红色表示。G0/G1.总体呈蓝色，S期总体呈棕色，G期总体呈蓝色2./M期人口呈绿色。
图3。0.12µM依托泊苷
使用FCS Express软件生成的0.12µM依托泊苷样本的总体直方图。在该药物浓度下，超过一半的细胞现在在G2./M阶段（见表2）。Sub-G1.人口为红色，G0/G1.人口以蓝色表示，S人口以棕色表示，G人口以蓝色表示2./人口是绿色的。
表2
| 细胞群 | %门控细胞 控制（µM） |
%门控细胞 依托泊苷（µM） |
|
|---|---|---|---|
| 0 | 0.06 | 0.12 | |
| Sub-G1. | 2.1 | 2.8 | 2.2 |
| G0/G1. | 54 | 45.9 | 18.9 |
| s | 26.4 | 23.2 | 24.9 |
| G2./M | 15.4 | 26.8 | 52.2 |
表2显示了对照细胞和依托泊苷处理细胞的总体分布。随着依托泊苷浓度的增加，在G2./细胞周期的M期也从15.4%增加到52.2%
图4
对照组的总体直方图，使用FCS Express软件生成的0.004、0.02、0.1µg/mL诺考达唑样本。细胞周期各阶段的数据如右表所示。随着诺考达唑浓度从0.004增加到0.1，在G2./细胞周期的M期从12.3%增加到47.7%
表3
| 细胞群 | %门控细胞 对照品（微克/毫升） |
%门控细胞 诺可达唑（微克/毫升） |
||
|---|---|---|---|---|
| 0 | 0.004 | 0.02 | 0.1 | |
| Sub-G1. | 6.9 | 6.7 | 12.1 | 9.1 |
| G0/G1. | 53.1 | 53.6 | 10.2 | 7.9 |
| s | 15 | 17.2 | 17.8 | 9.3 |
| G2./M | 14.3 | 12.3 | 41.4 | 47.7 |
图像细胞仪与流式细胞仪的相关性
纤维细胞计图像细胞仪与流式细胞仪
| 阶段 | 0.004微克/毫升 | 0.02微克/毫升 | 0.1微克/毫升 |
|---|---|---|---|
| G2./M | 12.3 | 41.4 | 47.7 |
| G2./M | 15.2 | 39.1 | 43.1 |
图（右）显示了在G点被捕获的细胞的百分比2./与诺可达唑孵育后的M期。两者之间有很好的相关性纤维视力计分析系统和FACS Calibur流式细胞仪。依托泊苷的类似相关数据见下文引用的Nexcelom出版物。
细胞周期的紫外线（UV）检测
有许多荧光染料能够与双链DNA结合。除了PI（如上所述），DAPI和Hoechst也是两种此类染料。由于结合荧光染料的数量与细胞内存在的DNA数量成正比，因此这些染料可用于检测细胞群体内的细胞周期。
下面是使用DAPI进行细胞周期检测的代表性示例。在本实验中，对照细胞和药物处理的细胞用DAPI染色，并使用纤维光度计进行分析。使用0.05µg/ml诺可达唑处理的细胞，在g2./与对照组相比，细胞周期的M期。
DAPI控制
| 细胞群 | %门控细胞 | 浓度 （10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 全部的 | 100 | 2 |
| 子G1. | 0.7 | 0.1 |
| G0/G1. | 55.9 | 1.1 |
| s | 10.2 | 0.2 |
| G2./M | 30.6 | 0.6 |
经处理的诺可达唑（0.05微克/毫升）
| 细胞群 | %门控细胞 | 浓度 （10^6个细胞/毫升） |
|---|---|---|
| 全部的 | 100 | 2.1 |
| 子G1. | 0.1 | 0.1 |
| G0/G1. | 17 | 0.4 |
| s | 8 | 0.2 |
| G2./M | 69.2 | 1.4 |
工具书类
细胞周期测定仪
陈，L。，等. (2011). Cellometer Vision可替代流式细胞术进行细胞周期分析、线粒体潜能和免疫分型。细胞仪A部分.79A:507-517。
哈娜·施梅瑟，等I型干扰素在某些人类癌细胞系中诱导自噬。自噬，2013年5月9日9时5分。