过继细胞转移治疗

过继性细胞移植疗法简介

新的癌症免疫疗法有了显著的增长。《科学》杂志将2013年的癌症免疫疗法称为“年度突破”，《自然》杂志发表了题为《召唤细胞武装起来》的展望文章。这些出版物突出了癌症免疫治疗研究领域的进展和增长。疫苗疗法、抗体疗法、免疫检查点抑制剂和过继细胞转移疗法都是免疫疗法研究领域的策略，旨在增强免疫系统对抗癌症的能力。

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过继细胞转移(ACT)疗法侧重于使用患者自己的细胞进行治疗。在ACT疗法中，有三种主要的治疗方法，利用细胞直接靶向和刺激免疫系统:肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、t细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)疗法。尽管刺激免疫系统的方法不同于另一种疗法，但它们都使用和需要初级的、纯化的和临床的样本。无论是用于ELISA或增殖试验的电镀细胞，还是用于从人源小鼠中分离TCR的工作，这些样品都经过常规处理和再处理，用于下游实验。在每个步骤中，细胞活力和浓度的测量仍然是免疫治疗发展过程中的一个重要因素。

测定细胞浓度和活力

用台盼蓝测定细胞浓度和活力

每台纤维计仪器都能执行台盼蓝排除法。在用台盼蓝染色细胞并将样品装入计数室载玻片后，Cellometer仪器自动捕获并分析多个细胞图像。在几秒钟内，结果表显示活细胞、死细胞和总细胞浓度、存活率以及平均细胞大小。

台盼蓝协议

  1. 用PBS将高汤(0.4%)稀释至0.2%。
  2. 用0.2微米过滤器过滤台盼蓝
  3. 细胞悬液以1:1与0.2%台盼蓝混合
  4. 将计数室放入测压仪并进行分析

简单，用户友好的Cellometer程序

1.移液管20µl 2。插入幻灯片3。选择分析并单击计数
4.结果在30秒!

用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)测定细胞浓度和活力

基于双荧光的仪器（Cellometer Vision、Auto 2000和K2）能够测量临床样本中有核细胞的浓度和活性，而无需进行红细胞溶解。仅将20µl样品添加到玻璃纤维计计数室。样品的成像和分析在30秒或更短的时间内完成。可以查看亮场和荧光细胞图像，以检查细胞形态和验证细胞计数。每个计数样本的总细胞计数、浓度和平均直径都会自动显示。

AO/PI协议

  1. 获得ViaStain™ AO/PI解决方案：请参阅我们的试剂部分
  2. AO/PI溶液1:1染色细胞
  3. 载荷计数箱滑动并分析

1.将20µl的样品移液到一次性载玻片中。

2.将滑块插入仪器

3.从下拉菜单中选择分析

4.点击计数，获取图像并查看细胞计数，浓度，直径

用于过继细胞转移治疗的人和动物细胞计数仪

人类黑色素瘤文摘

肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)分离的第一步是肿瘤标本的切除和消化。

  • 用Cellometer测定TILs的浓度和活力，用于肿瘤消化后的t细胞分离。
  • 我们推荐使用AOPI来测量细胞活力

AOPI染色的人类黑色素瘤消化样本

分离的T细胞

TIL分泌IFNγ表明分离的T细胞具有肿瘤特异性反应。进行ELISA分析以检测高水平的干扰素-γ（IFN-γ）。

  • 使用Cellometer测定酶联免疫吸附试验所需的t细胞浓度和活力。
  • 我们建议使用AOPI或TB来测量细胞活力

AOPI染色的分离T细胞

收获脾细胞

用肿瘤特异性抗原免疫小鼠。采集小鼠血清和脾细胞进行B细胞分离

  • 使用纤维测定仪测定采集的脾细胞的浓度和活力
  • 我们推荐使用AOPI来测量细胞活力

收获的脾细胞AOPI染色

孤立的b细胞

扩大选择的b细胞克隆用于杂交瘤的生产。

  • 使用纤维测定仪测定产生抗体的杂交瘤B细胞的浓度和活力。
  • 我们建议使用AOPI或TB来测量细胞活力

AOPI染色分离b细胞

hek293细胞

利用包装细胞株(hek293)进行病毒载体的生产

  • 使用纤维测定仪测定病毒载体生产所需的细胞浓度。
  • 使用纤维测定仪测定所产生病毒载体测试所需的细胞浓度。
  • 我们建议使用AOPI或TB来测量细胞活力

台盼蓝染色hek293细胞

人外周血单个核细胞

收集患者外周血淋巴细胞进行t细胞分离。

  • 使用纤维测定仪测定收集的PBMC样品的活性和浓度。
  • 白细胞分离+ Ficoll梯度后检测样品浓度和活力
  • 我们推荐使用AOPI来测量细胞活力

AOPI染色分离的人T细胞

孤立的人类t细胞

病人纯化的t细胞通常在转导或转染含有癌症特异性t细胞受体的载体之前被冷冻保存。

  • 冷冻前，使用纤维测定仪检查细胞的浓度和活力
  • 用Cellometer检测样品解冻后的浓度和活力
  • 在准备转导/转染时，使用纤维测定仪检查活力并确定最佳细胞浓度以进行电镀
  • 使用Cellometer检测细胞增殖过程中的细胞活力和浓度
  • 我们建议使用AOPI或TB来测量细胞活力

AOPI染色分离的人T细胞

台盼蓝染色分离的人T细胞

仪器的Cellometer系列可以通过台盼蓝或荧光法快速准确地获得细胞样本的活力。此外，系统在单个20µl分析中自动报告准确的细胞计数、浓度和细胞大小。基于荧光的玻璃纤维计仪器（Auto 2000、Vision和K2）还允许研究人员在不需要溶解红细胞的情况下计算新鲜临床样本中有核细胞的总数。下表概述了每种选定应用的推荐玻璃纤维计仪器和分析用途。

细胞类型 推荐的生存能力检测方法
台盼蓝 奥皮
杂交瘤细胞
293 t细胞
t细胞扩张
肿瘤消化
孤立的b细胞
脾细胞-新鲜
红细胞溶解后的脾细胞
PBMC,孤立
PBMC,新鲜
饲养细胞（K562细胞）

用Cellometer进行过继细胞转移治疗的分析

增殖试验

通过IL-21信号重编程cd19特异性T细胞可以改善b系恶性肿瘤的过继免疫治疗。Harjeet Singh等人。癌症研究;71(10) 2011年5月15日。

“在IL-2 (n=4)或IL-2和IL-21 (n=7)存在的情况下，γ辐照aAPC培养28天的t细胞生长速率。随着时间的推移，CAR+ t细胞的总数量不断繁殖。”

每7天对T细胞进行计数，并使用Cellometer自动细胞计数器（Nexcelom Bioscience的自动T4细胞计数器）根据台盼蓝排除法对活细胞进行计数。在电穿孔时和共培养过程中，程序“PBMC_人类_冷冻”和“活化T细胞”分别用于在玻璃纤维计上计数细胞。”乐动体育-南安普顿合作伙伴

HEK 293细胞转导/转染后GFP阳性细胞的百分比

  • hek293细胞在烧瓶中培养
  • 将含有eGFP报告基因的慢病毒载体以不同浓度添加到细胞中:对照组(无病毒载体)、样本1和样本2(如下图所示)。
  • 经过一段潜伏期后，收集细胞并用目测仪进行处理
  • 转导百分比=（总GFP+细胞/总亮场细胞）x 100
慢病毒转导 细胞总数 绿色荧光蛋白阳性 % GFP阳性
样本1 1244 718 58.0%
样本2 1404 337 24.1%
控制 1188 0 0.00%

控制

样本1

样本2

结论

Cellometer仪器能够对培养细胞系和原代细胞系进行浓度、活力和细胞大小测量，并执行癌症免疫疗法开发过程中常规使用的更复杂的基于细胞的分析。借助亮场和荧光平台，这些强大的仪器能够对大量样品进行一致和准确的细胞测量。基于双荧光的装置（Auto 2000、K2和Vision）能够测量临床样本中有核细胞的浓度和活性，而无需进行红细胞溶解。对于分离或纯化的细胞样本，亮场台盼蓝纤维测定仪（Mini、Auto 1000和T4）采集多幅图像，并在30秒内自动报告存活率百分比、细胞浓度和平均直径。这些仪器一起涵盖了免疫治疗领域研究人员可能需要的每一种细胞计数。

给我们打电话978-327-5340。有经验的Nexcelom应用专家cf欧洲杯竞猜美国东部时间上午8:30至下午5:30协助选择Cellometer系统。

使用Cellometer进行过继细胞转移治疗研究的出版物

  1. Talebian L，Wu JY，Fischer DA，等（2012年）增强多发性骨髓瘤自体免疫效应细胞的新动员策略前沿生物科学(精英教育)3: 1500–1508
  2. Singh H，Figliola MJ，Dawson MJ，et al.（2011）用IL-21信号重新编程CD19特异性T细胞可以改善B系恶性肿瘤的过继免疫治疗。癌症研究71(10): 3516-27
  3. Manuri PV，Wilson MH，Maiti SN，等（2010）piggyBac转座子/转座酶系统用于产生用于治疗B系恶性肿瘤的CD19特异性T细胞。人类基因治疗21(4): 427 - 37。

要查看引用用于用AOPI或TB测量细胞活力的纤维计仪器的出版物，请参阅我们的Viabilty应用程序页面。

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