免疫学中临床初级样本准确的细胞计数和活力测定
介绍免疫学
免疫学领域包括许多不同的研究领域，因此具有非常广泛的初级样本。这里我们列出了一些研究人员每天都在检查的重要样本。它们的范围从人类初级和临床样本到固定细胞系到小鼠模型的细胞样本。
尽管有各种各样的临床和初级样本，但大多数情况下浓度和活力是由单一的方法确定的:使用台班蓝血细胞计数。这种计数方法不一定适用于所有样品。骨髓、脐带血、组织消化液、支气管肺泡灌洗和其他初级和临床样本可能被残留的红细胞、组织和细胞碎片污染。这些污染物会导致免疫细胞计数不准确。
Nexcelom的解决方案是使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶进行荧光细胞分析。由于AO和PI是核酸染料，它们只能结合和标记活的和死的有核细胞的DNA。这种方法允许在任何样品中鉴定，枚举，以及提供有核细胞的细胞活力。
复杂初级样品中有核细胞的检测策略
使用吖啶橙（AO）和碘化丙锭（PI）染色和煤气流动仪自动细胞计数器直接测量总核细胞
- AO/PI按1:1比例染色
- 将20µl染色细胞标本装入计数室
- 使用Cellometer自动化荧光活力计数器计数和分析样品（Auto 2000，K2，Vision）
测量小细胞样品的细胞浓度和活力
使用荧光活力计数器在4个简单步骤中定量细胞样品
使用Auto 2000、K2或Vision双荧光Cellometer，只需将20µl的样品加入Cellometer计数室。样品的成像和分析在60秒内完成。可以查看明亮的视野和荧光细胞图像，以检查细胞形态和验证细胞计数。细胞总数，浓度和平均直径自动显示。
1.将20µl的样品移液到一次性载玻片中。
2.将幻灯片插入仪器
3.从下拉菜单中选择“测定”
4.单击“计数”，获取图像和查看单元格计数，浓度，直径
使用Cellometer Auto 2000检测免疫细胞样本
简单，用户友好的Cellometer程序
单击“编辑”按钮以更改此文本.1。移液管20μL2.插入幻灯片3.选择测定＆单击计数
4.结果30秒！
人类临床样本
骨髓(BM)
骨髓(BM)是一种复杂的组织，是造血和b细胞发育的场所。多能的非造血干细胞，如间充质干细胞，可以从人骨髓中分离出来。此外，通过稀释骨髓样品并进行密度梯度分离，可以分离出骨髓单核细胞(MNCs)。离心后，收集MNC层，通过细胞分选进一步分离各种亚群(造血祖细胞、间充质干细胞、CD33+髓系细胞和CD138+浆细胞)。
当前问题:红细胞样品污染可能导致免疫细胞的枚举不准确。
当前解决方案：在红细胞计数前溶解红细胞。
Nexcelom解决方案:进行荧光分析。使用AO/PI可用于单个核细胞的鉴定和计数，并提供计数样本中的细胞活力。
骨髓样本可以处理并用于许多不同的实验应用，如研究造血细胞分化途径和作为骨髓恶性肿瘤研究的对照。cf欧洲杯竞猜
AO法测定骨髓总有核细胞
AOPI染色的单个核细胞
AOPI染色的骨髓干细胞
在一个单独的实验中，用AOPI对三个人的骨髓样本进行染色、成像和分析。采集到的亮场(BR)图像与采集到的AOPI (F1F2)图像分别计数。如表(右)所示，在BR中被计数的粒子要比F1+F2中多得多。由于F1F2与BR的计数不是1:1，因此FL /BR的比值反映了这些计数。此外，三个单独实验中所列的比率在不同的实验中是不同的。比值变化是无核粒子在亮场成像的直接结果。由于标本的复杂性，我们认为骨髓标本中有核细胞计数应使用AOPI染色。
| F1F2. | BR | FL / BR比率 | 生存能力 | |
|---|---|---|---|---|
| MNC-BM_1 | 3296 | 4575 | 0．72 | 98.20％ |
| MNC-BM_2 | 1388 | 1605. | 0.86 | 98.60% |
| MNC-BM_3 | 2008 | 2935 | 0.68 | 98.20％ |
脐带血(CB)
脐带血(CB)在分娩时收集在一个含有抗凝剂的250ml标准血袋中。cb -单核细胞(MNC)可通过稀释脐带血标本进行密度梯度分离。离心后收集MNC层，通过细胞分选分离亚群(造血祖干细胞、CD34+中性粒细胞、CD14+单核细胞、CD19+ B细胞、CD3+、CD4+、CD8+ T细胞、CD56+ NK细胞)。
脐带血样本可以处理并用于许多不同的实验应用，如治疗造血、遗传和严重联合免疫缺陷(SCID)疾病。cf欧洲杯竞猜
用AOPI测量脐带血活细胞和死细胞总数
AOPI染色的单个核细胞
骨髓茎细胞用AOPI染色
5例脐带血标本用AOPI染色并成像。采集到的亮场(BR)图像与采集到的AOPI (F1F2)图像分别计数。如表(右)所示，在BR中被计数的粒子要比F1+F2中多得多。FL与BR的比值表明，在几乎每个样品中，BR中计数的颗粒数量是AOPI的两倍多。比值的变化是由在亮场中计数非核化粒子引起的。我们的结论是，在复杂的样本中，如脐带血，有核细胞计数应该使用AOPI。
| F1F2. | BR | FL / BR比率 | 生存能力 | |
|---|---|---|---|---|
| MNC-CB_1 | 2488 | 4659 | 0.53 | 98.10％ |
| MNC-CB_2 | 2613 | 7152. | 0.37 | 94.10% |
| MNC-CB_3 | 2313 | 5791 | ０．４０ | 93.30% |
| MNC-CB_4 | 1939年 | 3449 | 0.56 | 96.70％ |
| MNC-CB_5 | 2243 | 6450 | 0.35 | 95.80％ |
人外周血(又称全血)
将人外周血（AKA全血）从患者收集到含有含有抗凝血剂的小瓶中。全血是一种丰富的多元核细胞来源。可以使用各种隔离技术分离和纯化核细胞（祖细胞，B细胞，T细胞，树突状细胞，天然杀伤细胞，中性粒细胞，红细胞，血小板，单核细胞，巨噬细胞）。
脐带血样本可以处理并用于许多不同的实验应用，如:不同疾病的早期检测工具，研究新陈代谢和免疫途径，以及发现潜在的治疗性抗体。cf欧洲杯竞猜
AO测定全血有核细胞总数
与ao染色的被隔绝的单核细胞
AOPI染色CD19+ B细胞
孤立的嗜中性粒细胞与aopi染色
NK细胞CD56+ AOPI染色
HPC（人造血细胞）
HPC（人造造血细胞）人造造血原代细胞与外周血，骨髓或脐带血中分离出来。
CD34 +干细胞与AOPI染色
小鼠样本
鼠科的主要细胞。小鼠动物模型被广泛用于研究不同的人类疾病。我们定期收集和加工各种样品。获得细胞计数和活力是两个常见的过程，是标准实验室操作的一部分。
当前问题:在标准收获过程中，大量样品的加工非常耗时。此外，由于可能的样本种类繁多，可能需要多种方法来确定细胞数量和活力。
当前解决方案：血细胞计数器计数。
Nexcelom解决方案:进行荧光分析。使用AO/PI可以对采集的样本中有核细胞进行鉴定、计数并提供细胞活力。这个程序可以在许多不同的采集样品上执行。
进行了一项大型免疫学研究，在同一天采集并处理了30个小鼠淋巴细胞和脾细胞的个体样本。每个样品用AO/PI染色，用aCellometer汽车2000．获得所有样品的细胞总数、浓度和活力。
| Lym7 | Lmy6 | Lym2 | Lym 5 | |
|---|---|---|---|---|
| 总细胞计数 | 49. | 1419 | 10635 | 24245 |
| 活细胞浓度 | 1.07 e + 05 | 2.84E + 06. | 3.11 e + 07 | 6.75E + 07 |
| 生存能力 | 63.20% | 58.00% | 84.40% | 80.30％ |
| 明亮的现场细胞图像 |  |
 |
 |
 |
| 计算活/死细胞图像 |  |
 |
 |
 |
以上，是4种不同小鼠淋巴细胞样品（LYM7,6,2,5）的代表性组。每个样品都示出了亮场和计数的荧光图像。样品的浓度范围为1.07x105(已计数49个细胞)到6.75×107(共计数24245个细胞)，存活率为58.0% ~ 84.4%。由于在数据采集过程中可以保存图像，因此可以将它们用于记录计数单元格并进行可视化验证。
下面是30个收集和处理的淋巴细胞和脾细胞样本的数据表。下面报告的是活细胞的细胞计数、浓度和活力。所有样本使用相同的成像和计数参数。所有60个样本的总成像时间约为30分钟，而使用血球计的总计数时间约为2小时。
| 样本ID. | 细胞计数 | 浓度 | 生存能力 |
|---|---|---|---|
|
Ln 1 |
5627 |
1.94 e + 07 |
83.60% |
|
Ln 2 |
9283 |
3.20 e + 07 |
84.30% |
|
Ln 3 |
11694 |
4.03 e + 07 |
83.20％ |
|
Ln 4 |
8320. |
2.87 e + 07 |
82.90% |
|
Ln 5 |
21310 |
7.35 e + 07 |
81.60％ |
|
Ln 6 |
608 |
2.09E + 06. |
49.90％ |
|
Ln 7 |
19. |
6.55 e + 04 |
52.70% |
|
Ln 8 |
5944 |
2.05 e + 07 |
81.50％ |
|
Ln 9 |
1383 |
4.78E + 06 |
71.60％ |
|
Ln 10 |
3968 |
1.37 e + 07 |
75.20％ |
|
Ln 11 |
1641 |
5.66 e + 06 |
69.90% |
|
Ln 12 |
12408 |
4.28 e + 07 |
84.90% |
|
Ln 13 |
1456 |
5.02E + 06. |
76.40% |
|
Ln 14 |
2168 |
7.47 e + 06 |
76.30% |
|
Ln 15 |
3912 |
1.35E + 07. |
80.30％ |
|
Ln 16 |
3876 |
1.34E + 07. |
80.00% |
|
Ln 17 |
3836 |
1.32 e + 07 |
79.80％ |
|
Ln 18 |
2008 |
6.92 e + 06 |
70.60% |
|
Ln 19 |
1940年 |
6.68 e + 06 |
68.50% |
|
Ln 20 |
1535 |
5.29 e + 06 |
66.90% |
|
Ln 21 |
2103 |
7.25 e + 06 |
72.00% |
|
Ln 22 |
9048 |
3.12 e + 07 |
80.30％ |
|
Ln 23 |
2607 |
8.99 e + 06 |
71.80% |
|
Ln 24 |
8240. |
2.84E + 07 |
79.10% |
|
Ln 25 |
3571 |
1.23 e + 07 |
75.50% |
|
Ln 26 |
10520 |
3.62 e + 07 |
81.80% |
|
Ln 27 |
6069 |
2.09E + 07 |
82.40％ |
|
Ln 28 |
5913 |
2.04E + 07. |
74.50％ |
|
Ln 29 |
6457 |
2.22E + 07 |
74.00％ |
|
Ln 30 |
6296. |
2.17 e + 07 |
78.40% |
| 样本ID. | 细胞计数 | 浓度 | 生存能力 |
|---|---|---|---|
|
Sp 1 |
3840 |
1.32 e + 07 |
58.40％ |
|
Sp 2 |
6322 |
2.18E + 07 |
64.80% |
|
Sp 3 |
4055 |
1.40E + 07. |
63.60％ |
|
Sp 4 |
4990 |
1.72E + 07 |
58.70％ |
|
Sp 5 |
8204. |
2.82 e + 07 |
62.80％ |
|
Sp 6 |
7704 |
2.65E + 07 |
60.20％ |
|
Sp 7 |
8209. |
2.83E + 07 |
79.90% |
|
Sp 8 |
8999 |
3.10 e + 07 |
59.90% |
|
Sp 9 |
7870 |
2.71 e + 07 |
69.30% |
|
SP 10. |
7894 |
2.72 e + 07 |
69.30% |
|
SP 11. |
3967 |
1.37 e + 07 |
63.80％ |
|
SP 12. |
2659 |
9.19 e + 06 |
72.30% |
|
SP 13. |
1329 |
4.58 e + 06 |
61.40% |
|
SP 14 |
1290 |
4.45 e + 06 |
60.60% |
|
SP 15. |
2215 |
7.64 e + 06 |
60.70% |
|
SP 16. |
2222 |
7.66 e + 06 |
60.60% |
|
SP 17 |
5199. |
1.79 e + 07 |
70.50% |
|
SP 18. |
1895 |
6.53 e + 06 |
74.40％ |
|
SP 19. |
1769 |
6.09e + 06. |
60.50% |
|
周荣 |
3532 |
1.22 e + 07 |
59.50％ |
|
SP 21 |
1972年 |
6.79 e + 06 |
67.70% |
|
SP 22 |
1764 |
6.08 e + 06 |
62.40% |
|
Sp 23 |
2020 |
6.96 e + 06 |
64.60％ |
|
Sp 24 |
1156 |
3.98 e + 06 |
64.90% |
|
Sp 25 |
1244 |
4.28 e + 06 |
60.00％ |
|
Sp 26 |
3884 |
1.34E + 07. |
76.70% |
|
SP 27 |
1728 |
5.96E + 06. |
69.80% |
|
SP 28 |
2136 |
7.36E + 06 |
65.10% |
|
SP 29. |
2112 |
7.29E + 06 |
67.90% |
|
SP 30. |
1080 |
3.72 e + 06 |
65.70% |
小鼠尾静脉血
小鼠淋巴结
小鼠树突状细胞
老鼠消化耳朵
小鼠脾细胞
肿瘤消化
从患者处于肿瘤的主要来源的患者收集消化样品。在实验中可以在可以使用之前，首先需要在实验中消化和加工固体肿瘤。
当前问题:组织消化是天生的凌乱样本。它们可能含有组织碎片和细胞碎片，这使得识别和计数感兴趣的细胞变得困难。
当前解决方案：多次旋转碎片和洗涤样品。通过磁珠分离技术分离感兴趣的细胞。
Nexcelom解决方案:进行荧光分析。AO / PI染色允许鉴定，枚举，并在收集的样品中提供核细胞的细胞活力。
肿瘤消化的例子
AOPI染色的人类黑色素瘤消化样本
亮场图像，AO/PI图像&亮场和AO/PI叠加图像
鼠肿瘤消化样品与AO / PI染色
亮视野和AO/PI叠加图像(最右边)仅显示有核细胞的标记。
肿瘤细胞与淋巴细胞
淋巴细胞和肿瘤细胞混合物的明亮场和荧光图像与AO / PI染色
将淋巴细胞加入肿瘤细胞悬液中，用AO/PI染色。采集样品数据并对图像进行自动分析。细胞直径直方图显示，在我们的样本中有两个不同的群体:一个(红色)较小，直径约为6.0微米，另一个(绿色)是平均直径约为13微米的肿瘤细胞。
Bronchoalveolar灌洗（BAL）
支气管肺泡灌洗(BAL)是一种医疗程序，其中支气管镜通过口或鼻进入肺部，液体被喷射到肺的一小部分，然后重新检查。BAL标本可能含有肺和支气管上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和其他免疫细胞。来自人类或小鼠的BAL样本可以在Cellometer上进行分析。
当前问题:BAL样品含有细胞碎片，使得难以识别和计数感兴趣的细胞。
当前解决方案：免疫细胞分离纯化后，采用流式细胞术或人工计数对细胞进行计数。
Nexcelom解决方案:进行荧光分析。使用AO/PI可以对采集的样本中有核细胞进行鉴定、计数并提供细胞活力。
支气管肺泡灌洗样本
这些小鼠BAL样本是从多个单独的实验中收集的。各标本AO染色并成像。上图是亮场、AO荧光(FL)和BR-FL叠加图像的集合。
计数PBMC样品
- 分析外周血单个核细胞与分析骨髓、脐带血或全血中的有核细胞相似
- 目前使用血球计和光学显微镜计数PBMC的方法可能包括供者依赖的红细胞诱导计数误差
- 采用Cellometer图像流式细胞仪自动计数AO/ pi染色的有核细胞，消除rbc诱导的计数误差
结论和Cellometer选择指南
临床初级样本通常用于生物学、免疫学和癌症研究。样品的多样性和数量经常给计数和计算样品浓度和活力提出了一个挑战，以有效和准确的方式。Cellometer系列仪器为研究人员提供了多种工具，以执行快速和一致的有核细胞计数。即使在潜在污染物存在的情况下，血液和初级样品的荧光染色也可以准确识别和枚举有核细胞。下面的图表提供了一个快速的参考指南，Cellometer可能适合你的实验室!
请打978-327-5340给我们。有经验的Nexcelom应用专家可用cf欧洲杯竞猜美国东部时间上午8:30到下午5:30协助选择Cellometer系统。
| Cellometer迷你 | Cellometer汽车T4 | Cellometer汽车1000 | Cellometer汽车2000 | Cellometer Vision / Vision CBA | |
|---|---|---|---|---|---|
| 纯化细胞 - 没有碎片 |  |
|
|
 |
|
| 分离的跨国公司-不溶红细胞 |  |
|
|
|
|
| 新鲜BM, CB, WB，红细胞裂解的跨国公司 |  |
|
|
|
|
| 新鲜BM, CB, WB，未溶解 | |
|
|
|
|
| 冰冻BM, CB, WB | |
|
|
|
|
| 消化肿瘤和伴有组织/细胞碎片的BAL | |
|
|
|
|
=优秀=非常好=好=不推荐BM =骨髓，CB =脐带血，WB =全血，MNCs =单核细胞
使用Cellometer进行免疫学研究的出版物
- Singh H，Figliola MJ，Dawson MJ等。用IL-21信号传导重新编程CD19特异性T细胞可以改善B族血管性恶性肿瘤的养老疗法。癌症研究2011,15（10）：3516-27
- Chan LL，Zhong XM，Pirani A，Lin B.一种使用Cellometh图像基细胞测定法测量稀有细胞增殖的动力学测量方法。中国免疫学方法2012,377（1-2）：8-14
- Holmuhamedov El，Czerny C，Beeson CC，Lemasters JJ。乙醇在大鼠肝细胞中抑制尿素作用：乙醛的作用。中国生物化学2012,287（10）：7692-7700
- Ranguelova K, Rice AB, Khajo A, Triquigneaux M, Garantziotis S, Magliozzo RS, Mason RP。人中性粒细胞活化亚硫酸盐衍生自由基的形成:一项ESR研究。中国生物医学工程学报，2012,29 (4):529 - 534
- 作者简介:Lugli E, Gattinoni L, Roberto A, Mavilio D, Price DA, Restifo NP, Roederer M. human and nonhuman灵长目T干细胞记忆细胞的鉴定、分离和体外扩增。自然学报，2012,8(1):33-42
- Lo SURDO J，BAUER SR。检测人骨髓间充质干细胞中脂肪潜能和克隆因性患者供体和通道差异的定量方法。组织工程部分C方法2012,18（11）：877-89
- 陈丽丽，Laverty DJ, Smith T, Nejad P, Hei H, Gandhi R, Kuksin D, Qiu J.外周血单个核细胞浓度的精确测量消除红细胞计数误差。中国生物医学工程学报，2013,34 (1):25-32
- 杨志强，张志强，等。全血刺激法准确、简单地测定促炎细胞因子IL-1β。视觉实验杂志2011 1(49)