计算SVF处理方法比较

基质血管分数(SVF)简介

近年来，从脂肪组织中提取的脂质体已成为脂肪组织源性干细胞(ADSCs)用于自体细胞治疗的重要来源1、2、3．在吸脂完成后，必须加工原料脂脂酸盐以获得基质血管级分（SVF）。来自脂肪组织的基质血管级分含有细胞的异质混合物，包括内皮细胞，平滑肌细胞，围梗塞，白细胞，肥大细胞，成熟脂肪细胞，脂肪细胞和脂肪组织衍生的干细胞（ADSC）4、5．从SVF中计数活细胞是处理冰冻保存和/或细胞治疗样品的重要步骤。SVF中的大部分成分是有核细胞，可用核染料吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)和Hoechst 33342来枚举。

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碘化丙啶（PI）是膜排除染料，其经常用于用受损害的膜染色不可活性的核细胞。吖啶橙（AO）在细胞膜上自由扩散，并在所有核细胞中染色DNA。当组合AO和PI时，可以确定成核细胞的可行性百分比6,7．类似地，虽然带电的PI被活细胞排除，但是Hoechst 33342（Ho）穿过质膜渗透并可在活细胞中染色DNA6,7,8．根据这些染料特性，我们可以准确地获得总的有核细胞数量和细胞活力。

这里报道的数据显示了SVF样品计数方法的比较研究结果。在该实验中使用了三种检测方法，分析了两种单独的犬SVF样品：使用液压计视觉图像细胞仪的双荧光染色方法，流式细胞仪和使用血细胞计数计数。

细胞计、流式细胞仪和血球计计数的染色协议

Cellometer Vision CBA协议

将新鲜的SVF样品在PBS中稀释1：100。将样品与染色剂混合在1：1稀释。将Hoechst染色样品在37℃下孵育45分钟。将AO / PI与SVF样品混合在1：1的比例下并立即分析。

流式细胞分析仪协议

新鲜SVF样品在PBS中以1:100稀释。将75µl稀释SVF与75µl HO/PI溶液(2x stock)混合，37℃水浴孵育45分钟。将150µl的CytoCount珠制剂(Dako)加入到染色的SVF样品中，最终浓度为1:400。混合物在协同细胞分选机(iCyt/Sony)上分析，计数10000颗珠子。用珠与Hoechst阳性细胞(在犬PBMC上门控)的比例来测定每毫升SVF样本中活细胞和死细胞(PI阳性)的百分比。

血细胞计计方案

将新鲜的SVF样品在PBS中稀释1：100，随后1:10 Trypan Blue（TB）产生终浓度为1：1000。两个完整方块的平均值用于计算每mL SVF样品的％可行和死胞细胞。

数据分析

从每一种染色和计数方法获得细胞浓度

样品标识 样本复制 Cellometer AO + PI Cellometer Ho + PI 流HO +π 血细胞计计台盼蓝
示例1 1 2.53E + 08 2.54 e + 08年 3.22E + 08 3.00 e + 08年
示例1 2 2.82 e + 08年 2.29 e + 08年 2.01 e + 08年 2.60E + 08
示例1 3. 2.51E + 08 1.94 e + 08年 2.09E + 08 3.30E + 08
示例1 4. 2.04E + 08 没有数据 2.21E + 08 3.20e + 08
大街 2.47E + 08 2.26E + 08 2.38 e + 08年 3.03 e + 08年
STDEV. 3.19E + 07 3.01e + 07 5.64 e + 07 3.10E + 07
示例2 1 3.27E + 08 2.50 e + 08年 2.82 e + 08年 2.60E + 08
示例2 2 3.05e + 08 2.70E + 08 2.86E + 08 2.70E + 08
示例2 3. 2.66 e + 08年 3.31 e + 08年 2.87 e + 08年 2.90E + 08
示例2 4. 2.37E + 08 2.61 e + 08年 2.57E + 08 2.40E + 08
大街 2.84 e + 08年 2.78 e + 08年 2.78 e + 08年 2.65E + 08
STDEV. 4.04E + 07. 3.63e + 07 1.42 e + 07 2.08E + 07.

计数方法之间的一致相关性

具有代表性的细胞计图像显示SVF样本的活力染色

样品1的Cellometer图像1：SVF与AO + PI染色

Cellometer图像显示亮视野(左)，AO染色(中)和AO染色计数的细胞(右)到“Cellometer图像显示亮视野(左)，AO染色(中)和AO/PI计数合并图像(右)。由于细胞活力高，合并图中可见绿色AO阳性细胞

Cellometer 2的样品2：SVF与HO + PI染色

Cellometer Image展示明亮的场（左），Hoechst染色（中央）和Hoechst染色的电池（右）到“Cellometer Images展示明亮的场（左），Hoechst染色（Center）和Hoechst + PI计数合并的图像（右）。由于高可行性，仅在合并图像中看到活成核细胞。

结论

初级间质血管组分(SVFs)的特点是细胞类型的复杂性，通常在每个样本中发现。这种复杂性并非没有一些缺点。如上面的亮场图像所示，SVF样本中有大量的细胞碎片，这大大增加了获取正确细胞数量和活力的能力。

在这项研究中，我们将Cellometer Vision CBA平台与使用血晶计以及流式细胞仪进行了手动计数。结果表明，这些计数方法之间存在较大的相关性，具有云计平台与流式细胞仪之间的最大相似性。

通过使用像AO / PI和Hoechst / Pi等染料的细胞核，它显着提高了适当和准确的计数和活力的置信度。另外，在明亮场和荧光通道中浇出小碎屑的能力确保获得正确的细胞计数。

使用小样品体积（20μL）的同时执行快速染色（AO / PI染色的瞬时）和分析（用于成像和分析的30秒），使得Cellometer Vision CBA成为获得细胞浓度和活力的理想系统基质血管分数。

参考文献

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