台盼蓝与AO/PI染色方法的比较

介绍

测定细胞活力是许多生物实验中的重要组分,其从标准细胞培养到肿瘤细胞上的药理剂的研究。最早和最常见的测量细胞活力的方法之一是台盼蓝(TB)排除测定[1,2]。在过去二十年中,在比较TB排除和基于荧光的细胞活力测定[1,3-5]上有各种出版物。先前的结果表明,与基于荧光的方法相比,TB排除测定报告的可释放显着较高的可活性[4,5]。这些以前的研究只显示了比较结果,但没有提供有关潜在原因的证据。在这项工作中,我们进行了使用自动图像的细胞测定方法(Cellometom,Nexcelom Bioscience)用Tb和AO / Pi测量的时间课程研究以比较用Tb和AO / pi测量的细胞活力。乐动体育-南安普顿合作伙伴

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结核病和荧光

材料和方法

吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)是可用于测量细胞活力的核酸结合染料。AO和PI都被认为是皮肤刺激物,如果摄入或吸入可能是有害的;它们目前没有被归类为致癌物质。由于AO是细胞可渗透的,所以所有染色的核细胞都会产生绿色荧光。PI(〜668道尔顿)仅进入具有受损膜的细胞,因此用PI染色的染色,死亡和坏死的核细胞产生红色荧光。当细胞用AO和PI染色,活成核细胞只能荧光绿和死亡的细胞只能荧光红色。这是由于Förster共振能量转移(FRET);其中PI信号吸收AO信号,不会产生溢出或双阳性结果。另外,其他膜排除活力染料如:溴化乙锭(EB),7AAD,Sytox Green / Red,DRAQ5等也可以代替PI。通过检查Live的数量与死荧光细胞数量的比率来计算细胞活力。 This assay can not only be used to measure the viability of nucleated cells in cell culture and purified samples but also in complicated samples such as PBMC, whole blood, bone marrow, bronchoalveolar lavage, tumor digests, primary samples and many more.

Jurkat细胞准备

Jurkat细胞在RPMI-1640培养基中培养。对于室温温育细胞的可活力比较,将一个烧瓶从培养箱中取出并置于台式抽屉中。将烧瓶保持在室温下进行实验的其余部分。在下面的时间点从烧瓶中除去一小等份的细胞:0,6,12,24,48,72,96和168小时。进行了类似的实验,以研究不同Tb浓度对Jurkat细胞活力的影响,其在下列时间点测量:0,3,6,9,12,27和33小时。(时间点比第一次实验短,因为它朝向时间框架瞄准,其中在图2中显示的活力差异是最明显的。)对于热冲击活力比较,Jurkat细胞被置于沸水中15闵。在热冲击后,通过在适当的体积处混合热杀死和新鲜的Jurkat细胞,在0,25,50,75和100%的活力下制备五个样品。

室温培养Jurkat细胞的时间-过程活力

采用四种检测方法测定和比较室温培养的Jurkat细胞的活力和浓度:(1, 2) PI或AO/PI染色测定活力并用Cellometer Vision计数;(3)0.4% TB染色用Cellometer auto4计数;(4)0.4% TB染色用血球计手工计数。AO/PI染色过程如前所述[6]。将0、6、12、24、48、72、96和168 h室温培养的细胞样本与PI、AO/PI或TB混合,立即用Cellometer Vision、auto4和血球计进行分析。在所有时间点以全份数测量活力和浓度。

台台蓝浓度相关的活力比较

通过两种检测方法测定Tb浓度对室温温育的Jurkat细胞的活力的影响:(1)通过AO / Pi测量活力,并用Cellometer Vision计数,并用各种浓度的Tb和手动染色(2)染色用血谱表计数。每个室温温育细胞样品在0,3,6,9,12,27和33小时,与AO / Pi或0.4,0.4,0.2,0.1,0.05,0.025,0.0125%的TB混合,并立即通过Cellometer Vision进行分析和血谱仪。在所有时间点以全份数测量活力和浓度。

热休克生存能力比较

将新鲜采集的Jurkat细胞分成两等份,一份用煮沸的方法热休克15分钟(100%不活细胞),另一份不活细胞(100%活细胞)。然后将这两种不同配比的细胞混合,制成细胞悬液。测定每种热休克/活活力混合物(0、25、50、75和100%)的活活力和浓度,并采用三种检测方法进行比较:(2) 0.4% TB染色,Cellometer auto4计数;(3)0.4% TB染色,血球计手工计数。每一个热休克/活混合样品与PI或TB混合,立即用图像细胞仪和血球计进行分析。对所有五种混合物,分别在四重重复中测定三个独立实验的活力和浓度。

图像细胞计数自动化程序

用PI,AO / PI或Tb染色的Jurkat细胞在混合到Nexcelom一次性计数室后立即移液。Cellometer Vision可以分别利用VB-535-402(伪色绿色)和VB-660-502(假色)的荧光(FL)光学模块分别检测AO和PI。Cellometer Autot4使用彩色相机来检测TB染色的Jurkat细胞。对于TB图像分析,列举了用明亮中心(BF)中具有TB染色的明亮中心和黑细胞的活细胞。对于PI图像分析,列举了FL通道中的BF和死区中的总细胞。对于AO / PI图像分析,枚举了绿色和红色通道中的AO染色的活细胞和PI染色的死细胞。

血球计手工细胞计数规程

结核菌染色的Jurkat细胞立即被移液管移入纽鲍尔血球计。在光镜下对受控热休克和室温培养Jurkat细胞的样本手动枚举活细胞和死细胞。使用存活率约50%的细胞样本进行手工计数。

结果

在时间试验结束时,手册和结核病测量浓度都比基于荧光的检测方法低两倍以上。此外,TB测量的死细胞数量的初始偏差开始于室温培养12小时后,同一时间AO/PI测量的细胞活力下降到~70%。这些数据表明,随着细胞活力的下降,TB排除方法低估了死亡细胞的数量,从而产生了一个膨胀的活力测量。(d)

四种检测方法表明,基于荧光的检测方法与结核排除试验之间存在明显差异。(一)

  • 将AO/PI与PI、AO/PI与TB染色进行比较,在12 h时进行双样本t检验。结果显示,AO/PI与PI染色法具有可比拟性(p > 0.05),而AO/PI与TB计数法有显著性差异(p≤0.05)。
  • 在24 h时,TB测定的存活率约为80%,AO/PI或PI为70%。

通过AO / PI和PI方法测量总浓度,其显示结果一致的结果,而TB方法显示出随时间逐渐减少。(b)

测量活细胞浓度并在两种方法之间显示出没有差异,然而死细胞随时间比TB方法显示出的AO / PI和PI方法浓度较高。(C)

AO/PI和TB染色的室温培养Jurkat细胞的BF图像。在培养后0 - 168h的时间点测定样品。红色和绿色箭头分别表示BF图像中大的、昏暗的和弥散的细胞。

从0到12小时的细胞与热休克细胞相似;外细胞膜呈暗色,界限分明。到168h时,细胞呈灰色,未被识别。观察到类似的形态特征,细胞膜由清晰可见(紧密且染色深)变为无定形(大而弥散)。

结核染色大而暗的细胞数量随时间增加,AO染色Jurkat细胞的形态特征在同一时间内没有变化。我们目测证实染色(AO/PI和TB)死亡Jurkat细胞数量随时间增加。

测量细胞活力的最优方法是AO/PI方法,该方法允许双荧光检测(活的和死的),从而消除了对细胞膜贫瘠细胞群的不准确计数:晚期凋亡和坏死细胞,以及消除了对细胞碎片的计数。

随着时间的推移(培养后0-33小时;红色箭头),与低浓度相比,高浓度的结核病显示出更多的这些细胞。(图3)

AO/PI染色与前次实验保持一致,实验过程中PI阳性细胞增多。

在图4中,与之前一样,从每一种结核浓度测量的存活能力都高于AO/ pi染色细胞的计数。同样,当用两样本t检验计算所有结核浓度的AO/PI时,活细胞浓度彼此具有可比性(p > 0.05)。AO/PI与所有TB浓度相比,每个实验参数测量的死亡细胞浓度有显著差异(p≤0.05)(b, c)。与之前的时间过程实验一样,即使在高TB浓度下,我们观察到报告的死亡细胞数量也相当低。

这些数据不仅支持我们之前的发现,即TB活力测量估计测量的样本活力百分比,而且还表明在每个测试的TB浓度下发生这种现象。

在各种活力百分比的图5中,Tb和Pi染色热震动Jurkat细胞的BF和FL图像。在这些热震动的Jurkat样品中,TB图像显示出在活细胞和死细胞之间的明显区别,其中死细胞表现出密切的暗和明确定义的形态。类似地,BF图像中的死细胞保持易于检测的蜂窝膜。

在热震动和室温温育细胞之间也存在明显的形态学差异。因为热震动的细胞没有经历自然凋亡细胞死亡和坏死,所以染色的Jurkat细胞形状,颜色和圆度均匀。相反,在室温(如图3所示)在室温(见图3)中孵育的细胞表现出非均匀的细胞形态和不均匀的TB染色图案。

由于热休克细胞的形态均匀性,TB和PI之间的生存力计数与理论生存力具有高度的相关性。(Figire 6)在本实验中,由于缺少细胞碎片,使用PI代替AO/PI。相反,在室温下培养的细胞会产生大量的细胞碎片。因此,需要AO/ PI来准确测定样品中有核细胞的活力,而不受细胞碎片[7]的干扰。

图7显示了Tb浓度下大暗暗细胞(“气球'')和深闭(死)形状的Jurkat细胞的时级浓度测量。(a)0.4%,(b)0.1%,(c)0.025%。(d)浓度结果(室温下孵育33小时)表明,在较高的Tb浓度下,暗点,漫射细胞或“气球”的数量非常高,比较最低Tb浓度的浓度。

图1.室温温育Jurkat细胞的时间课程可行性

AP/PI与台盼蓝的存活率

图2。TB、PI和AO/PI染色室温培养Jurkat细胞浓度和活力的时间过程测量

图3。台盼蓝浓度依赖性生存能力比较

图4。台盼蓝浓度依赖性生存能力比较

图5.热震动和新鲜Jurkat细胞之间的可存活率比较

图6。热休克与新鲜Jurkat细胞活力比较

图7.时间课程和昏暗的百分比,“气球”细胞与死亡,“暗”细胞以各种TB浓度

结论

本研究的目的是调查结核菌排除试验和荧光活性染色之间的差异和可能的原因。多年来,两种可行性检测方法进行了大量的比较,但这些报告并没有对结核病引起的形态学改变提出任何可能的解释。

室温培养的Jurkat细胞的细胞膜在细胞死亡期间发生了极端的变化。在具有高活力的样本中,结核染色的死细胞表现出紧密、黑暗、均匀的特征。这一观察结果表明,即使细胞可以渗透到结核菌,细胞膜仍然保持完整,足以在胞质中保留结核菌染料。

在低活力的样本中,结核染色的死亡细胞表现出大、暗、不均匀的扩散特征,提示细胞膜完整性功能丧失。在这些细胞中,结核菌不包含在细胞质中,这导致了观察到的大而暗淡的细胞的形成。

由于在光镜下血球计中较暗的细胞可能难以计数,TB排除试验可能由于意外地排除死亡细胞而人为地产生较高的生存计数。结果,两种方法测量的生存力显示出显著的差异,高达30%,类似的观察已经在以前的出版物[5]。

室温培养和热休克细胞之间的形态学差异也可以潜在地解释TB和基于荧光的方法比较中存活率报告的差异。

此外,我们检查了可能由不同浓度的TB引起的潜在形态学变化。在染色具有较高浓度的Tb(0.4%)的细胞时,我们观察到大暗散射圆形的快速形成(“气球”;图9)可以在光学显微镜和液位度计下观察。气球的尺寸和亮度似乎不同,比其他更清楚地弥漫。

在较低的Tb浓度(0.025%),我们没有观察到许多气球状细胞(图9)。在0.025%Tb时,染料的浓度可能太低,不能充分染色所有死细胞。尽管气球的性质使它们难以计数,但是在横跨TB浓度的光学显微镜下仔细识别并手动地识别出气球。我们观察到,在33小时的时间点,对于0.4和0.1%的浓度,显着增加了比黑暗死细胞的扩散球囊细胞显着更高(对于两种Tb浓度)。0.025%的浓度浓度不仅有计数的气球数量与计数死细胞数量(p≤0.05),但也存在较少的总计数细胞;可以归因于低染料浓度。

这些数据表明,Tb在高浓度下,对膜受损的死细胞具有形态学作用,从而产生类似气囊状细胞。在较低浓度的TB,这些染料诱导的效果未观察到。

最后,由于这些死亡细胞呈模糊的弥漫性彩色球囊结构,很难看到和计数,这导致了对样本中生存能力测量的过高估计。

其他潜在原因对于基于TB和基于荧光的方法之间的差异也可以假设。例如,已经显示PI以进入比TB的细胞,因此有可能测量更多的死细胞。而且,由于Tb是一种细胞质染料,其染色细胞内蛋白质,由于膜完整性的损失,具有膜降解变化的染色细胞可能不会保持Tb。结果,可以降低计数的死电池的数量,这又可以产生更高的存活率测量。同时PI,嵌入染料与细胞的核酸结合,无论膜完整性如何保留在细胞核内。它是因为这些性质常规用于染色并鉴定晚期凋亡和坏死性细胞群[8,9]。

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