基因治疗发展的现代细胞基础分析原则

概述Nexcelom解决方案和相关技术如何消除基因治疗的应用、优化和改进中的障碍。

基因治疗的总体目标是修饰基因表达治疗疾病[1] [https://www.asgct.org/education/more-resources/gene-and-cell-therapy-faqs].研究人员在20世纪70年代首次开发出分子生物学技术时,就开始思考如何实现修饰[2-4].这些尖端疗法提供功能性基因有效载荷,这与使用已知数量的药物有很大不同。为患者体内受影响的细胞提供精确的基因剂量对安全性和有效性至关重要,需要准确的量化和彻底的临床前测试。此外,从实验室到临床需要广泛的免疫原性测试,因为基因治疗产品的每一个成分,从载体到货物到治疗蛋白,都能引起免疫反应。基因治疗是由美国食品和药物管理局的生物评估和研究中心管理的。有关FDA指南的更多信息,请点击此处[5-11].

基因治疗有三种主要方法:

  1. 更换突变的基因和正常的副本
  2. 灭活防止基因突变造成更大的伤害
  3. 介绍一种治疗疾病的新基因

基因治疗是通过在活的有机体内离体治疗

宽泛地说,基因治疗是离体在活的有机体内[12,13].离体基因治疗涉及从患者收获细胞,修饰DNA,膨胀修饰的细胞,并将它们注入患者。在活的有机体内基因治疗当靶细胞在体内改变时,基因治疗直接给予患者。这种方法在技术上是具有挑战性的,因为它需要有效地将有效载荷传递给受影响的细胞和或组织,其中必须有效地表达基因。基因治疗利用四个广泛的类别来解决这些问题:基因修饰的细胞基免疫治疗,病毒载体,非病毒载体和基因编辑[17-20].

两种主要类型的基因治疗

有两种主要类型的基因疗法:例如,体内和体内。图像信用https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-engene-therapy-products/what-gene-actions.

在四种主要的基因疗法中,病毒载体在转染或转导宿主细胞方面非常有效。因此,截至2017年,在进行的3000多项临床试验中,约70%使用了病毒载体[21.].

基因治疗主要有四种类型

四种主要类型的基因治疗:基因修饰细胞免疫疗法,病毒载体,基因编辑,和非病毒载体

通常,基于病毒载体的基因治疗开发遵循几个相对复杂的工作流程[22.].首先,基因治疗产品的独特之处在于它们是在哺乳动物细胞中产生的,因此在临床前研究和开发中选择和分离合适的靶细胞是至关重要的。接下来,根据以下考虑选择合适的向量:

  • DNA负载能力
  • 转导效率
  • 细胞热心
  • 靶细胞有丝分裂状态
  • 基因/细胞毒性
  • 对人体没有免疫反应

随后,需要测定的发展来确定转导效率,以确保将适当的基因转化为所选细胞类型。最后,由于安全问题,研究人员需要筛查患者血清中的筛选抗体以测试转导抑制。

AAV矢量开发过程流程图

AAV矢量开发过程流程图。

基因治疗研发的当前技术

基因治疗的研究和发展采用了多种技术和方法,如PCR、细胞分析、LC-MS、流式细胞术、ELISpot等。基于细胞的检测是学术界和工业界最常用的基因治疗发展方法之一。

这些现有技术也面临着各种挑战:

  • 灵敏度
  • 鲁棒性
  • 用于方法开发和验证的样品可用性
  • 选择性地
  • 所有分析所需的样品可用性
  • 示例矩阵类型
  • 样本稳定性

基于病毒载体的基因治疗研究可以在开发和优化基于细胞的测定时遇到挑战:

  1. 设计有效的载体
  2. 提高转换效率
  3. 优化文化条件
  4. 银行细胞
  5. 测量基因表达
  6. 缩放生产
  7. 有效递送到细胞在活的有机体内(由于预先存在的中和抗体)

图像细胞术测定可提高细胞计数和基于细胞的测定速度和效率

Nexcelom的图像细胞计数仪和自动细胞计数系统支持基于病毒载体的基因治疗研究和开发的三个重要方面。首先,我们为细胞计数、测量转导效率、增殖、活力、细胞毒性、细胞凋亡以及其他生物现象提供快速、友好的解决方案,以支持研究人员开发新的基因疗法。此外,图像细胞检测法可以用于检测患者样本中存在的可能阻止治疗有效的抗体,并帮助监测治疗期间的免疫反应。

  1. 质量控制发展高质量的细胞培养物
    1. 快速细胞计数
    2. 准确评估增殖和生存能力
    3. 细胞培养条件优化
    4. 克隆选择和验证
  2. 选择和微调适当的AAV向量
    1. 同时评估转导效率和表达水平
  3. 开发筛选测定以鉴定患者预先存在的抗体
    1. 筛选患者载体中和抗体
    2. 基于细胞的在体外中和测定

用于使用图像细胞术进行细胞计数和基于细胞的测定的总体益处

  • 在96孔和384孔板上进行无标记细胞增殖试验,每个板5分钟
  • 直接细胞计数以确定从6-孔板到1536孔板的转导效率和表达水平
  • 高速、高通量、全孔成像用于细胞检测的质量控制
  • 用四种荧光颜色15分钟内在96孔板中基于细胞的抗体结合测定
  • 高通量细胞计数器提供精确的细胞计数和活力的24个样品在不到3分钟

基因治疗研发可以利用Nexcelom图像细胞术和自动细胞计数系统,并专注于基于细胞的测定和细胞计数的关键改进区域。

提高产品开发的研究、效率和质量

基于细胞的测定对于基因治疗和发展非常重要。使用图像细胞仪和自动细胞计数系统来优化基于细胞的测定。

  • 电池的质量
    • Caspase 3/7或Annexin V的细胞计数,活力和细胞凋亡可以在实验前确认细胞的质量(通过CELLOMETTOM频谱汽车2000年, 或者K2
    • 可以快速评估大量样品(24个样品在<3分钟内测量Cellaca MX
    • 细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和衰老等先进的基于细胞的检测可以在96孔或384孔板上进行Celigo
  • 细胞培养条件优化
    • 培养基和试剂优化可以通过评估6- 96孔板中孔内细胞增殖(通过Celigo
    • 需要高吞吐量计数(通过Cellaca MX),以评估多种情况
  • 转导和表达效率
  • 单细胞克隆验证
    • 需要全井成像来确保单胞间单圈,并且可以通过明田殖民地产物或直接使用荧光来快速确定(通过Celigo

筛网预先存在于血清AAV的抗体

  • 一种基于抗体或血清的中和试验
    • 对病毒载体的预先存在的免疫可以导致中和,并且需要基于细胞在体外用于筛选的转导抑制试验(由Celigo

监测免疫应答

  • 用elisa法测定血清水平的体液免疫应答
    • ELISA分析需要准确的PBMC计数(通过Cellaca MX
  • ELISPOT IFN的T细胞免疫应答测试
    • 需要精确的PBMC计数进行ELISpot分析(通过Cellaca MX

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