使用明场成像直接测量病毒细胞病变效应(CPE)

细胞病变效应(CPE)是由目标感染病毒引起的宿主细胞形态的变化所指示的[REF医学微生物学,第4版。第44章对细胞的影响肉眼可见宿主细胞肿胀或收缩、圆形、溶解、斑块、团块、合胞体和包涵体。一般来说,具有引起宿主细胞变性能力的病毒称为细胞病原性病毒。有不同程度的CPE由不同的病毒引起,其中一些病毒可以完全和迅速地破坏宿主细胞单层,而其他病毒改变宿主细胞的形态[REF Erica Suchman, Carol Blair. 2007.]。病毒协议的细胞病变效应]。

病毒性细胞病作用CPE

BSC40细胞(左),MOI <0.01 PFU / CELL感染后48小时(中心),MOI = 10 PFU / CELL(右)

是什么让一个很好的细胞病变效果测定?

需要考虑有几个关键因素,以便设置和执行良好的CPE测定。下面的列表显示了为什么他们对CPE测定发展很重要的因素和原因。

  1. 宿主细胞播种密度-培养足够多的宿主细胞以快速生长并覆盖井表面是至关重要的,这使得CPE发生时能够更好地可视化。如果宿主细胞的融合不接近100%,那么病毒是否诱导了CPE就会有一些不确定性。
  2. 病毒浓度- 在CPE测定之前进行病毒滴度实验是重要的,以确定病毒浓度的适当范围,以获得适当的TCID50结果。
  3. 吞吐量-利用基于板的图像细胞检测方法,检测通量可以从标准的6 - 24孔板显著提高到96孔和384孔板。
  4. 成像-图像细胞术可以快速扫描整个板的整个孔,数字化捕捉亮场和荧光图像进行分析。与传统的显微镜方法不同,后者需要人工观察CPE,而且缺乏数字记录。
  5. 分析-图像分析算法可以通过破坏细胞单层、减少宿主细胞数量和单个细胞水平的形态变化自动识别CPE。相比之下,传统的CPE分析需要训练有素的技术人员目视检查和识别,这是冗长、耗时的,并产生高水平的不确定性。

使用Celigo Image Cytometer直接分析细胞病变效应

Celigo形象血细胞计数器是一种复杂的板成像仪,可以在明亮的场和荧光中快速图像整个微孔板。利用强大的内置图像分析软件,Celigo可以快速生成斑块,焦点和个体感染细胞的数量,形态学测量以及荧光强度。它可以使用不同的图像分析和计数方法来分析CPE,这些方法适合于对病毒和宿主细胞配对定制。使用明亮的场成像,科学家可以使用明亮的场成像进行高吞吐量自动化和分析板中的CPE,没有任何标签。

  1. 速度:使用我们的自动图像采集和分析工具小于10分钟/板块
  2. 创新:在没有胰蛋白酶化的情况下计算每种感染的细胞和每种感染的细胞和总细胞
  3. 更快的结果:早期的斑块检测可降低测定持续时间
  4. 单一系统:对焦形成测定的自动化明亮场和基于荧光计数
  5. 方便:通过集成一个板堆垛机,每天分析多达50个板,从而节省时间

Celigo图像cytometer采用专有的图像分析算法,该算法已经针对软件中的独特病毒学应用程序套件进行了优化。有3种图像分析方法用于量化CPE,例如销毁细胞单层,宿主细胞计数减少,以及单个细胞水平的形态变化。

1.使用汇合应用来测量宿主细胞单层

伪绿色表示细胞存在的地方,这个区域被量化,并在不同的病毒治疗之间进行比较。

融合应用

健康细胞(左)和感染细胞(右)

2.计算每个孔中的细胞总数

绿色的轮廓线表示井中已计数的单元格。CPE在这里表现为细胞数量的总体减少。

融合应用

健康细胞(左)和感染细胞(右)

3.测量宿主细胞的形态变化

纵横比从计数的细胞测量以量化形态变化。宿主细胞的圆形可以是细胞的指示,并且可以量化来自健康细胞的形态的这种形态差异。

形态变化

健康细胞(左)和感染细胞(右)

利用Celigo图像细胞仪进行形态学分析

利用Celigo软件中的门控功能可以进行形态学量化,特异性识别不同大小、不同光洁度、不同纵横比、不同平均强度和不同综合强度的细胞。

利用Celigo图像细胞仪进行形态学分析

示例图像分析使用Celigo软件中的门控功能识别圆形和细长的单元格

SARS-COV-2病毒导致对VERO细胞的细胞病变作用

以下是被SARS-COV-2感染48小时的Vero细胞的例子,表现为单分子层的丧失,呈圆形和肿胀。

SARS-COV2引起的CPE

由SARS-COV2引起的CPE的明亮场成像固定在感染后48h。所有3个图像分析算法都可以应用于实验。左右显示,汇合分析:单层区域的丧失,细胞计数分析:细胞丧失,高对比度和圆形细胞计数:感染的细胞显示CPE。

用于分析CPE阳性和阴性样本之间的汇合百分比的通用CPE测定方案

  1. 种子微孔板中的宿主细胞并允许孵育并粘附过夜
  2. 宿主细胞接种阳性对照(病毒)和阴性对照(媒体)
  3. 扫描微孔板并以时刻的方式使用Celigo多次分析
  4. 利用宿主细胞汇合率测量对CPE进行量化
  5. 直接报告CPE结果在Celigo软件中

使用Celigo图像cytometer执行的示例CPE测量: