直接计数溶细胞斑和荧光标记细胞及病灶的快速传染性病毒滴度测定

病毒滴度是研究传染病、发病机制、疫苗开发、甚至细胞和基因治疗的研究人员的一项基本检测。主要目标是确定下游检测中使用的适当病毒浓度,如抗体中和、基于ELISA的中和、抗病毒治疗发现、细胞病变检测效应(CPE),或简单的基因和细胞治疗慢病毒转导。

特别是在病毒学研究中,传染性病毒滴度对于临床研究和测试至关重要。传统的病毒滴度测量非常费力、主观,而且由于人工实验,数据点往往受到限制。

什么是传染性病毒滴度测定?

有多种方法可以测量样本中的病毒数量,如实时(RT)PCR、Western Blot、ELISA和流式细胞术。这些方法利用病毒DNA、RNA或蛋白质的数量来量化病毒。然而,这些方法并不能测量病毒的实际生物活性。为了调查病毒的传染性,体外需要进行分析以评估候选抗体的中和能力以及抗病毒小分子药物的有效性。进行传染性病毒滴度测定以确定病毒对宿主细胞的强度。

如何测量传染性病毒滴度?

病毒传染性是传染性病毒的一个关键特征,它表明病毒在宿主细胞中感染和复制的能力。为了确定病毒传染性,可以进行两类分析。第一类是定量分析,包括斑块形成分析(PFA)第二类包括终点稀释试验,包括50%组织培养感染剂量(TCID50)、致死剂量(LD50)和鸡蛋感染剂量(EID50)。

通常的做法是对病毒原液进行连续稀释,感染宿主细胞,并使用各种方法测定传染性和病毒滴度。传统上,病毒滴度是通过形成的斑块、病灶或单个感染细胞的数量来定量的。斑块形成试验(PFA)和焦点形成试验(FFA)通常用肉眼或显微镜(光/荧光)计数。单个感染细胞可以用常规的流式细胞仪测量。

检测传染性病毒滴度的工作流程
检测方法 描述 存在的问题
肉眼(灯箱) 在6孔板或12孔板中手动计数结晶紫染色的大溶细胞斑(PRNT) 低吞吐量、劳动密集型、耗时、操作员变化、需要大量(6、12、24孔板)、无数字记录
标准显微镜 在96孔板中手动计数用辣根过氧化物酶标记的小病灶或单个感染细胞 低吞吐量、劳动密集型、耗时、操作员变化、无数字记录
数字自动显微术 自动获取用荧光探针(即免疫染色或荧光蛋白)标记的小病灶或单个感染细胞的荧光图像。接下来,使用外部软件(即ImageJ)自动分析和计数小病灶或单个感染细胞 耗时,而不是简化,需要多个步骤
流式细胞术 自动计数和分析用荧光探针(即免疫染色或荧光蛋白)标记的单个感染细胞的数量 耗时,需要从平板上对宿主细胞进行胰蛋白酶消化,无法检测到大斑块或病灶,必须使用荧光标记

什么是细胞病变效应(CPE)?

细胞病变效应(CPE)是病毒感染对宿主细胞的影响。宿主细胞常见的视觉观察是肿胀或收缩、圆形、溶解、结块、合胞体和内含物。

病毒细胞病变效应

BSC40细胞(左),感染后48小时moi<0.01 pfu/细胞(中),moi=10 pfu/细胞(右)

什么是空斑形成试验(PFA)?

当受病毒感染的宿主细胞因感染而溶解时,可在宿主细胞的单层中产生开口,形成斑块。根据感染性病毒的类型,斑块的形成可能需要3-14天。此外,宿主细胞、培养基和pH值会影响斑块的大小和数量。此分析需要数天才能完成,因此吞吐量较低。用眼睛手动计数可能会很乏味和耗时。操作员之间的差异对结果的一致性有很大影响。最后,斑块形成所需的时间很长,因为斑块需要变得足够大,以便手动计数。

病毒斑块形成试验
菌斑计数
67 19 4. 2.
63 13 2. 0
菌斑大小(µm)2.)
453017.801 478668.211 375579.65 58492.7559
481462.961 313941.745 382699.547

什么是焦点形成分析(FFA)?

通常,当感染性病毒不溶解宿主细胞,但仍能感染周围细胞时,进行病灶形成试验。这会产生称为病灶或病灶的感染细胞簇。可通过使用辣根过氧化物酶(结合初级抗病毒抗体)对病灶进行特异性标记,荧光病毒蛋白标记物,或荧光病毒报告器,可提高可视化和计数。此外,与斑块不同,病灶形成需要更短的形成和计数时间。

病毒焦点形成试验

使用Celigo图像细胞仪自动计数斑块、病灶和单个感染细胞

Celigo图像细胞仪是一种高通量高速平板成像仪,可以在明亮的视野和荧光中快速成像整个微孔板,以产生计数、形态和强度测量。这是最快的成像仪,可用于执行病毒滴度分析。为了表征病毒感染的行为,科学家可以直接在平板上进行高通量自动成像和分析,直接在平板上计数感染细胞,而无需胰蛋白酶。

  1. 速度:使用我们的自动图像采集和分析工具,不到10分钟/张
  2. 创新点:在没有胰蛋白酶的情况下,计算每个孔中的每个感染细胞和总细胞数
  3. 更快的结果:更早的菌斑检测缩短了检测时间
  4. 单系统:自动亮场和基于荧光的聚焦形成分析计数
  5. 方便性:通过集成每天最多分析50个板材的板材堆垛机,获得时间

用于计算辣根过氧化物酶或荧光标记单个感染细胞的通用病毒滴度测定方案

  1. 将宿主细胞接种并允许其粘附在96孔微孔板表面24小时
  2. 将不同浓度或数量的病毒颗粒添加到培养皿中,以测量病毒的传染性
  3. 被感染的细胞被固定并用一级抗病毒抗体和二级辣根过氧化物酶(HRP)或直接结合荧光抗体或荧光病毒蛋白标记
  4. 然后使用Celigo图像细胞仪对宿主细胞样本进行成像和分析,以计算感染细胞的数量或感染率

查看图像细胞仪如何用于执行各种病毒学分析: