当前SARS-COV-2研究

COVID-19大流行增加了全球对SARS-CoV-2的研究。为开发新的治疗方法和有效的抗病毒药物而全力以赴的竞赛导致了三种公开可用的疫苗现代化辉瑞(mRNA为基础),和约翰逊和约翰逊(病毒载体为基础的)。SARS-COV-2 RNA基因组大约为30个碱基长,使其成为最大的病毒基因组中的一个,在创建学习使用反向遗传学病毒的挑战。产生感染性病毒目前需要研究人员采用非常规的方法非典型传统RNA病毒的两个组成部分是需要的是存在于宿主的真核细胞生成或拯救传染性病毒。

  1. 病毒的遗传物质必须编码在酵母人工染色体(YAC)或细菌人工染色体(BAC)中,并转染到细胞内。
  2. 病毒的核衣壳需要以反式(12).这些系统已经研制成功,研究病毒的致病性在体外在活的有机体内用记者。

什么是反向遗传学?

生物的分子研究有两种类型的遗传研究。正向遗传学研究的是确定一个特定表现型或身体特征的基因。而第二种则相反,即反向遗传学(RG),即通过改变基因序列并观察这些变化如何在物理或分子水平上影响生物体来研究基因的功能。由于DNA重组技术的进步,这种基因分析成为可能。RG涉及对遗传物质的操纵,通常通过位点定向突变、基因缺失和转座子突变来诱发表型,从而使研究人员了解基因功能(3.).

SARS-COV-2的示意图质粒icDNA

图1. SARS-COV-2具有ICDNA的质粒的示意图

简化SARS-COV-2和变异的研究

随着对大流行的关注日益增加,公众每天都可以广泛获得SARS-CoV-2及其几种临床变异的全基因组(4.5.).这种重要信息可以帮助研究人员开发一种简化的RG方法,用于构建类似于病毒基因组的合成质粒。如犀牛所述。et.al在他们最近的文章中,一种方法使用质粒系统通过简单地通过用感染性cDNA(ICDNA)转染质粒(incdna)来拯救宿主细胞中的传染性病毒6.).这种简单的方法使以前没有研究冠状病毒的不同实验室有能力通过一次转染产生具有传染性的SARS-CoV-2克隆。此外,这种遗传系统允许引入荧光报告,如mCherry, ZsGreen,或纳米荧光酶(NLuc),以快速检测病毒。

的噬菌斑测定SARS冠状病毒-2-

图2:SARS-COV-2表达MCHERRY和ZSGEEN的噬斑测定。在5个通道突变之后,导致非荧光病毒的培养物中的3个重复中的1个。

与图像相结合流式细胞术反向遗传学以确定突变和病毒噬菌斑

Covid-19研究开发的这个RG系统使用了使用Celigo高通量图像仪检测并量化荧光斑块的百分比。这有助于确定在大多数病例中,荧光病毒似乎在不引入突变的情况下保持稳定。一旦突变发生,在这种情况下,荧光消失,这个菌株就会接管培养。该RG工具在该领域的另一个优势是能够轻松生成和验证针对病毒结构和非结构蛋白的抗体。使用传统的生化技术,包括western blot、免疫沉淀和免疫荧光,抗这些病毒蛋白的抗体显示出对受感染细胞染色和识别蛋白-蛋白相互作用的有效性(6.).这种方法有助于识别ORF10蛋白的表达,以前被认为是不产生蛋白质的基因misannotated(7.).

适应高吞吐量开发

去年的研究表明,SARS-CoV-2可以感染多种细胞类型(8.),需要两种因素才能有效感染人体细胞,血管紧张素转换酶2 (ACE2)和TMPRSS丝氨酸蛋白酶。ACE2是主要受体,而TMPRSS会裂解病毒的S蛋白,引发病毒感染。使用传统的慢病毒转导技术,细胞系可以独立或串联表达每一种因子,因此科学界很容易获得这两种因子。这些细胞系可以很容易地适应中通量和高通量格式,用于筛选抗病毒化合物,开发候选疫苗,并确定感染机制。

所述Celigo图像流式细胞仪被用来得分响应于相比Remdesivir药物Apilimod致细胞病变效应。该系统具有多路传输能力,允许将药物(EC 50)的有效剂量的确定以及所述细胞的生存力,以评估化合物的毒性。结果表明Apilimod成功减少病毒在细胞中表达只有ACE2但不是TPRMSS2感染性(6.).该结果突出了能够有效确定感染机制的有效工具以及在感染期间发挥着许多宿主因素的作用。

为了证明该工具包的有效性,我们使用许可细胞系分离了3个临床分离株(CVR-GLA-1, CVR-GLA-2)。CVR-GLA3)。结果表明,这些临床分离株在表达ACE2和TMPRSS的许可细胞系中生长增强。此外,该工具包产生的抗体能够特异性结合临床分离的目标蛋白。这进一步验证了用于临床分离和进一步重要研究的试剂(6.).

那么间隙法

图3:嗯间隙检测。所述Celigo图像流式细胞仪被用来得分响应于Apilimod细胞病变效应。表达细胞只ACE2 + Apilimod是对感染具有抗性。然而,在ACE2和TMPRSS2表达的细胞变得宽松。EC50是从上Celigo图像流式细胞仪捕获的数据进行计算。

总的来说,这RG工具包由三个部分组成:1)与病毒icDNA质粒,2)针对结构和非结构蛋白的抗体,以及3)允许细胞系,研究了可用于社区感染的机制。因此,提供的病毒学领域额外的工具来快速表征新的病毒株和评估对病毒感染的小化合物的有效性。

参考

  1. Thi Nhu Thao等等。利用合成基因组学平台快速重建SARS-CoV-2。自然582., 561 - 565(2020)。
  2. c .你们等等。从单个细菌人工染色体中拯救SARS-CoV-2。MBio11.(2020), doi: 10.1128 / mBio.02168-20。
  3. A. J.格里菲思,J. H.米勒,铃木大拙,R. C.列万廷,W. M. Gelbart的,反向遗传学(2000)。
  4. D. Licastro等等。,分离及意大利北部COVID - 19例SARS-COV-2的全基因组表征。J.Virol。94(2020),DOI:10.1128 / JVI.00543-20。
  5. H.王等等。所述的遗传序列,起源和SARS-CoV的-2的诊断。欧元。J. Clin。微生物。感染。解释。39.,1629年至1635年(2020年)。
  6. s . j . Rihn等等。质粒DNA发射SARS-CoV的-2反向遗传学系统和冠状工具包COVID-19研究。Plos Biol。19.,E3001091(2021)。
  7. d .金等等。SARS-CoV-2转录组的结构。细胞181,914-921.e10(2020)。
  8. y . j .侯等等。,SARS-COV-2反向遗传揭示呼吸道中可变感染梯度。细胞182,429-446.e14(2020)。