提高准确性和加速疫苗和抗病毒化合物评估

目前还没有批准的抗病毒药物或推荐的疫苗来预防或治疗猫冠状病毒感染。科罗拉多州立大学的研究人员认为,需要一种比传统的斑块减少中和试验(PRNT)更快、更灵敏的方法。如本文所述,科学家们开发了一种新型的高通量病毒微中和试验,使用基于平板的图像细胞仪更快、更容易量化病毒感染细胞、测试抗病毒药物和研究发病机制。

Celigo图像细胞仪减少了检测时间,同时提供了更丰富的定量读数,以加速疫苗和抗病毒化合物候选的评估。重要的是,这种优化策略可用于使其他细胞类型适应该检测格式,或创建全新的病毒-宿主细胞组合。”

同时进行全井和全板成像和分析

在这项工作中Celigo形象血细胞计数器与亮场以及绿色和蓝色荧光成像通道一起检测和计数FCoV感染的猫肾细胞(CRFK)粘附上皮细胞。首先用Alexa Fluor 488 (AF488)标记和DAPI对感染细胞进行荧光染色。在对每个孔中的细胞进行自动聚焦后,Celigo同时进行全孔和全板成像和分析,以生成绿色荧光感染细胞的百分比。

阳性和阴性CRFK细胞感染的荧光强度门控

图1所示。利用图像细胞术优化的扫描和分析设置,Brightfield和荧光图像,以及阳性和阴性感染CRFK细胞的荧光强度门控

首先,软件使用蓝色通道识别出dapi阳性宿主细胞的总数。接下来,测量AF488荧光强度,确定哪些细胞对感染呈阳性,确定感染百分比。以细胞播种密度、平板表面涂布、病毒浓度、孵育时间、洗涤缓冲液和荧光标记为实验参数进行优化。

病毒浓度优化结果

图2病毒浓度优化结果。(左)病毒浓度依赖的荧光图像和(右)感染率测量显示,随着病毒浓度降低,af488阳性的感染CRFK细胞减少。培养基和上清对照均未显示病毒感染。

病毒中和的结果

图3。病毒中和结果显示,用1:10到1:1280的滴定法测量了5个猫血浆样本的剂量依赖性感染率。病毒和血浆条件与预期一致,呈现高感染率和低感染率。未观察到明显的中和效果。

将优化后的检测方法用于高通量微中和筛选潜在的FCoV抗体,使用收集的5份猫血清抗FCoV- wsu -79 - 1146。高通量中和试验进行了两次。由于猫血清中I型和II型FCoV病毒缺乏交叉中和作用,没有确定可行的候选病毒。

每96孔板进行大约15分钟的微中和试验

筛选疫苗和候选治疗药物以及评估免疫反应的传统方法通常耗时、通量低,可能需要几天时间。缺乏数字自动保存功能会导致记录保存存在问题,而且由于多个用户产生不同的结果,记录的可重复性也是一个问题。Celigo通过同时成像和分析数据的数字自动保存节省时间,使记录毫不费力。此外,预设功能节省时间和资源,并防止延长用户培训或操作人员易变性问题。“图像细胞仪在每96孔板大约15分钟内进行中和试验,同时在亮场和荧光中获取和分析全孔图像,相当于每个样品约9秒。”


猫冠状病毒图像细胞检测的高通量病毒微中和方法

第一作者:摩根·皮尔森,微生物学系,免疫学和病理学

第一作者机构:科罗拉多州立大学,科罗拉多州柯林斯堡80523,美国

杂志:病毒学方法杂志