鉴于世界目前的国家,病毒感染实验已成为一个越来越重要的研究课题。病毒可能是棘手的,因为它们每个都有自己的感染细胞的方法,并因其感染率而变化。当试图了解这些区别时,有一个起始病毒滴度或MOI非常重要。有许多方法来确定病毒滴度,每个方法具有其优点和缺点,然而,增加需要具有高通量方法以确定病毒滴度是迫切的。

病毒滴定分析方法可分为两个主要类别,功能或非功能。非功能性测定包括病毒抗原ELISA,通过QPCR逆转录酶活性,或使用QRT-PCR定量病毒RNA定量。这些方法困扰着真正的病毒滴度的估计。病毒抗原ELISA可以是病毒滴定的非常敏感的输出,但是游离抗原以及非功能性病毒抗原可以偏斜结果。QPCR可以识别病毒基因组的最小基因组拷贝,但结果也将受到非功能性病毒的阻碍。测定细胞中的逆转录酶活性是病毒滴定的一个很大的起点,但它不能明确地提供活性病毒拷贝的直接输出。

功能性滴定方法更熟练通过评估活细胞中的直接病毒转导的真实病毒感染数目。一些功能方法包括斑块测定和荧光病毒记者。这些测定通过从掺入病毒基因组中的报道基因的病毒裂解或荧光表达,通过分解死细胞(斑块)的区域来鉴定病毒活性。这两种方法都是病毒感染性的直接测量,并基于活细胞数和抑制病毒上清液的精确病毒滴度值。

MDCK细胞感染流感病毒

用野生型感染的MDCK细胞和荧光标记的流感病毒描绘功能滴度测定

对任何病毒滴定法的主要挑战能够以高通量方式准确地评估多种样品。诸如斑块和荧光测定的功能性滴定方法最擅长扩展到高通量分析,但受适当仪器的限制。这Celigo图像cytometer是一种这样的工具,可以弥合精确的病毒滴定分析和快速高通量捕获之间的差距。

Celigo图像细胞仪如何使病毒滴定测定易于执行?

全井快速成像是答案。Celigo可以在几分钟内捕获整个Microwell板的图像,同时计算单个细胞以确定感染率。这与病毒荧光报告系统非常好,因为可以通过使用明菲尔场图像来识别每个单独的细胞,或者为了更好地精确核污染,例如Hoechst或DAPI,然后探测荧光信号的存在。

Raji细胞:BR进行分割

Raji细胞:BR进行分割

Vero细胞:BR进行分割

Vero细胞:BR进行分割

Vero细胞:用于分割的Hoechst

Vero细胞:用于分割的Hoechst

Raji和Vero细胞用于使用Celigo图像cytometer的标记为Zika病毒的GFP

然后可以通过串联稀释粒子来推断病毒滴度。GFP表达总细胞系的百分比将随着添加量的大量病毒而增加,并且可以容易地绘制以产生IC50曲线,如有必要。还可以毫不费力地将该信息与传统的荧光病毒滴定方法相比,I.SCAS分析。

病毒滴定曲线

Zika感染细胞对FACS的Celigo图像细胞仪产生的病毒滴定曲线的比较

病毒滴定可以是潜在疫苗候选的高通量筛选的限制步骤。确定滴定方法,无论是功能还是非功能,都可以提高精度,并允许扩展到高通量分析或限制所述实验的结果。无论选择方法如何,用快速图像和细胞分析系统耦合该方法可以大大改善无数实验时间的结果。

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参考

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