空斑测定保持为感染性病毒粒子和抗病毒物质的通过分立斑的在细胞培养物的计数的直接定量的最常用的方法之一。这个技术首先用于计算噬菌体股票的滴度和它已被用于许多不同的病毒的滴度的可靠的确定1

噬菌斑分析:传统的方法

在噬斑测定,宿主细胞的汇合单层的感染未知浓度,已连续稀释至可数范围内,通常为5-100病毒粒子之间每孔的裂解病毒。根据所使用的病毒生长动力学和宿主细胞,可见开放斑块(面积不宿主细胞,由病毒裂解)通常会在2-14天形成。固定和染色被感染细胞单层后,计数噬斑,从而使滴度病毒原样品中的噬斑形成单位(pfu)的术语。

改进斑块的检测方法早期发现

有时,目标病毒不会引起宿主细胞的裂解,因此需要被感染的宿主细胞的任何比色或荧光标记揭示病毒斑。发表在最近的一篇文章分子疗法:方法和临床开发2通过Masci等人发表。作者所述的噬斑测定协议如何典型与辣根过氧化物酶 - 缀合的抗体和底物随后通过眼睛计数执行繁琐的,耗时的,而且容易操作错误。相反,他们提出了利用荧光标记的抗体和使用的荧光方法Celigo图像流式细胞仪以减少在自动图像采集前培养检测所需的时间。如图1所示,荧光法可以将检测长度从6 - 7天缩短到4天。

斑块的检测工作流程

图1传统空斑检测流程与图像细胞检测流程的比较

荧光空斑测定法的可靠性

通过与传统手工计数法的比较,验证了荧光计数法的可靠性。两种方法之间有很好的相关性。更重要的是,他们展示了如何使用荧光方法在孵育24小时后定量斑块的数量,而传统的检测方法需要花费72小时。同样重要的是,他们表明,在24小时后任何时间检测到的荧光斑块数量保持一致,为该检测带来了额外的稳定期(图2)。

血小板计数可视化

图2斑块计数和可视化使用荧光染色与HRP染色

结论

作者的结论是“通过利用自动计数和计数斑块的计算机算法,分析师主体被移除。使用成像器Celigo也显著减少菌斑计数时间并提高了数据一致性”。

1https://www.creative-biogene.com/support/Viral-Titering-Plaque-Assay-Protocol.html

2Masci,A. L.,Menesale,E. B.,陈,W. C.,钴,C.,陆,X.,与Bergelson,S.(2019)。和基于图像的自动荧光检测的一体化计数增加速度,灵敏度和耐用性斑块检测的。分子治疗方法与临床发展14., 270 - 274。