介绍

由于它们的正确折叠和翻译后改性人类蛋白质的倾向,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生物制药的选择的选择。在这里,研究人员使用优化的生物信息化工具(“脆皮”)来产生称为“单引导”RNA(SGRNA)的嵌合RNA以破坏FUR8,该基因在N-糖基化中使用。这种基于网络的工具可确保效率,快速,且低成本的CHO细胞遗传操作,以供未来的生物制药应用。cf欧洲杯竞猜

材料和方法

细胞培养和转染CHO细胞

CHO细胞培养并通过核代特试剂盒V与1μgCAS9质粒和1μg的SGRNA质粒转染。两天后,用PMAXGFP转染细胞,并使用Nexcelom的Celigo评估转染效率。

FUT8敲除细胞表型分析

转染5天后,选择试剂镜头culinaris加入凝集素(LCA)。(LCA结合血浆膜蛋白,导致下游细胞死亡。LCA用作Fut8敲除细胞的选择剂,因为LCA不能与Defoid8的细胞结合。)用Hoechst(图像中的红色)染色细胞进行表型分析和荧光素- 标记的LCA(F-LCA;图像中绿色)。Fut8野生型电池将染色绿色,而Fut8敲除细胞不会。用Celigo捕获明亮场和荧光图像。

*注意:更详细的资料和方法,以及整个研究的完整描述,请参阅原稿[http://onlineLibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.25233/abstract.

结果

  • LCA选择导致控制细胞变得不粘附和圆润。
  • Cas9和sgRNA转染的细胞仍然贴壁,说明FUT8在这些细胞中成功敲除。
  • 不经LCA选择转染Cas9和sgRNA的细胞显示F-LCA阴性细胞占总细胞数的29.1%。
  • 用Cas9和SGRNA转染的细胞,具有LCA选择,显示98.6%的细胞是F-LCA阴性,如其他研究证明缺乏功能Fut8 [2-4]。
图1 a - c。FUT8敲除细胞表型分析。分别用Cas9质粒单独或Cas9质粒加sgRNA转染细胞。第6天拍摄亮场图像(A)。第13天细胞用Hoechst染色(红色)和荧光素标记的LCA染色(绿色)。在C中可以看到F-LCA阳性(FUT8野生型)和F-LCA阴性(FUT8敲除)图像的量化。

图1 a - c。FUT8敲除细胞表型分析。分别用Cas9质粒单独或Cas9质粒加sgRNA转染细胞。第6天拍摄亮场图像(A)。第13天细胞用Hoechst染色(红色)和荧光素标记的LCA染色(绿色)。在C中可以看到F-LCA阳性(FUT8野生型)和F-LCA阴性(FUT8敲除)图像的量化。

结论

  • 这种rna引导CRISPR Cas9应用成功阻断了CHO细胞中的基因。
  • 基于Web的生物信息化设计工具“CRISPY”为基因操纵CHO细胞提供了有效的低成本方法。

参考

  1. 贾亚帕尔,k.p.等人,CHO细胞的重组蛋白治疗- 20年和计数。化学工程,2007。103.: 40-47页。
  2. L. Malphettes等人,使用锌指核酸酶在CHO细胞系中高效删除FUT8可以产生产生完全非聚焦抗体的细胞。Biotechnol Bioeng,2010。106.(5): 774 - 83页。
  3. 森,K。等。,利用FUT8 siRNA工程中国仓鼠卵巢细胞以最大化产生的抗体的效应功能。Biotechnol Bioeng, 2004年。88(7): 901 - 8页。
  4. Yamane-Ohnuki, N.,成立Fut8淘汰赛中国仓鼠卵巢细胞:一种理想的宿主细胞系,用于生产完全脓肿的抗体,具有增强的抗体依赖性细胞细胞毒性。Biotechnol Bioeng, 2004年。87(5): 614 - 22页。